荧光定量PCR实验中的策略及注意事项.pdfVIP

荧光定量PCR 实验中的策略及注意事项 前一段时间在百度中有哪些信誉好的足球投注网站，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR 技术 的PPT 有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自 己对社会有点看得见的贡献了。考虑到自己作为荧光定量PCR 仪的技术支持人员 已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的 时间，写点荧光定量PCR 实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对 相关的人员有些参考价值。 荧光定量PCR 原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些 有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR 与荧光定量PCR 技术区别？ 简单的讲PCR 技术最早是用于扩增一段特异的PCR 片段，用于克隆、测 序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR 片段有无或非很粗的相对定量，而 荧光定量PCR 技术则是为了测定样本中特异的PCR 片段相对及绝对量，是一种测 定特异的PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某 一特定的mRNA 的含量等。 前些年有人讲过普通PCR 后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR 产物的定 量与PCR 样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX 这些方法如何选择？ 从实验成本来讲，Sybr Green 是最好的，基本上就是普通PCR 加上一点 Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等， 但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR 反应的检测，另一个问题是非特异性 扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究 人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR 反应的检测 可以满足实验要求，则Sybr Green 是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2 种或以上的反应， 则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探 针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的 扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这 一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高， 有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的 优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon 的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX 探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman 和Molecular beacon 方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方 案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green 法 选择单通道实验还是多通道实验？ 这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行 比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是 可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦， 即多种PCR 反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另 一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难 是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会 让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即 一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。 可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。 三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通 道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。 双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？ 对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是 复性温度，可用PCR 仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。 对于如何确定是否存在相互干扰，则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验 的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题， 可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primer limited，在一般的PCR 反应 中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优 化引物浓度时，用不同的引物