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中困荫物学第Pq届会员代表大会堑全困第七届菌物学学术讨论会
任海霞宫志远h李瑾任鹏飞姚强曲玲
(山东省农科院土壤肥料研究所济南250100)
摘要:本试验以平菇黑丰268为材料,对影响其随机扩增多态DNA(RAPD)PCR反应体系的主要因素进行
了优化筛选。确定了最佳反应体系为:20¨LPCR反应体系中,M92+浓度为1.4mmol/L,模板浓度为50ng,引物
2.0pL。
浓度为0.6~o.8pmol/L,dNTPs浓度为250pmol/L,Taq酶浓度为1.2U/20pL,10xBuffer
关键词:平菇,RAPD.PCR,体系优化
食用菌是我国农业的传统产业,2005年我国食用菌产量已达1000多万吨,平菇是我国
食用菌栽培的主要品种,其产量占食用菌总产量的50%,占世界食用菌总产量的25%(陈国荣,
2007)。虽然《食用菌菌种管理办法》已于2006年6月1日起施行,但是目前平菇菌株名称仍然
很混乱。同名异物、同物异名现象严重,侵权问题普遍存在(张金霞,2006)。这在一定程度上
挫伤了育种工作者的积极性,严重影响了食用茵产业的正常发展。要解决这些问题,最需要的就
是技术支持,需要有一套简单、有效、实用的菌种鉴别技术。
DNA)SP随机扩增多态性DNA,它是建立在PCR基础之
RAPD(randomlyamplifiedpolymorphic
上,使用一系列具有10个碱基的单链随机引物,对整个基因组DNA进行PCR扩增以检测多态性
(WilliamsJGK,1990;WelshJ,1991)。RAPD分子标记以其简单、快速、经济等优点正在被广
泛应用于食用菌的研究中(黎裕,1999),其应用和发展前景广阔。但是这种方法也存在稳定性差
的缺点,由于单链引物随机结合在众多反向重复序列上,因而每次得到的实验结果可能不一致,
对于这些问题可以通过优化实验参数、选择合适的引物等手段来加以克服。为了提高RAPD—PCR
的稳定性和可靠性,本研究对RAPD-PCR反应条件进行优化,建立了平菇RAPD.PCR反应体系。
l材料与方法
1.1供试菌株
供试平菇菌株黑丰268、易丰18、丰5、夏优1号等由山东省农科院土壤肥料研究所提供。
1.2培养基
PDA斜面培养基:马铃薯2009,葡萄糖209.KH2P0439,MgS04.7H201.59,琼脂209,水
1000mL,pH自然。
39,MgS04.7H201.59,水1000mL,pH
液体培养基:葡萄糖409,蛋白胨49,KH2P04
自然。
1.3试剂与引物
引物由上海生工合成,其它试剂皆由天根试剂公司提供。
1.4实验方法
1Al菌丝体培养及收集
挑取保藏菌种接种于PDA斜面培养基上,25C活化培养7.10天后,转接种到液体培养基中,
水分,用液氮迅速冷却,备用。
1.4.2DNA提取
采用改进的SDS法提取DNA(王景雪,2000)。
1.4.3试验条件设置
·基金项目:山东省农科院青年基金项目(2006YQN029),农业部行业科技专项。华北地区食用菌菌种质量评价与
菌种信患系统研究与建立”(nyhyzx07—008),山东省农业良种工程项目“山东名产和优势食用菌新品种选育”
(2007LZ06)
“通讯作者:gongzhiyuan@saas.∽.∞
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