蚯蚓抗肿瘤成分的分离和研究(第一阶段小结).pdfVIP

全国农业生化与分子生物学会第八次学术研讨会论文集 蚯蚓抗肿瘤成分的分离与研究(第一阶段小结) 张治国1连桂芳1 陈洪2 (1．南京农业大学生命科学学院南京210095，2．东南大学中大医院南京210009) 蚯蚓养殖是改良土壤、促进植物生长、净化环境、转化有机废弃物为优质的动物性蛋白 饲料与颗粒有机肥料的新兴产业。蚯蚓还是我国传统的中药材，本草纲目中有40个药方包 含蚯蚓；目前蚯蚓已成为提取生化药与保健食品的重要原料。上世纪80年代起，屡有利用 蚯蚓粗提物治疗肿瘤取得显著疗效的报导。我们希望进一步揭示蚯蚓抗肿瘤的有效部位与有 效成分及其抗肿瘤的效果，同时探讨抗肿瘤的机理。 1蚯蚓不同蛋白组分的细胞毒试验 取新鲜赤子爱胜蚓(髓senia G75凝胶层析，分别收集蛋白峰I、II、III， 度盐析，沉淀物经透析、浓缩、通过Sephadex 透析、浓缩、冻干。以尿激酶标准品、用纤维蛋白平板法测定蚯蚓纤溶酶活性，活性单位用 尿激酶单位(uku)表示。在蚯蚓提取物中，纤维蛋白溶解活性集中于蛋白峰II。 分别用蚯蚓的3个组分(蛋白峰I、II、III)对3株对数生长期的肿瘤细胞(胰腺 USA)在450衄测定每孔培养物的光密度，或用MTT法，计算肿瘤细胞的抑制率。试验结果 表明：只有富含蚯蚓纤溶酶的第1I组分具有显著的细胞毒作用，蚯蚓的另2个蛋白组分对 3株肿瘤细胞都不具明显的抑制作用。 2蚯鲺纤溶酶的细胞毒试验 蛋白组分II经DEAE—Sepharose4B离交层析、梯度洗脱，收集合并纤溶酶洗脱峰，透 析、浓缩、冻干。冻干的蚯蚓纤溶酶用Native(胶板含0．25％纤维蛋白)检测，出 现4—5条纤溶酶带。 结果表明：10株肿瘤细胞的繁殖均受到不同程度的抑制，抑制率与纤溶酶的浓度呈量效依 细胞的半数抑制浓度为2．79uku／ml。特别注意到：当纤溶酶浓度在1．22—9．OOuku／mL对 并不会刺激红自血病细胞K562的繁殖。 3蚯蚓纤溶酶在荷瘤鼠的抑瘤试验 昆明小鼠在接种肉瘤S180或艾氏腹水瘤的次日起，试验组灌服本酶的水溶液、每日2 次；阳性对照组注射5一Fu(20mg／Kg．d)；阴性对照组灌服生理盐水。S180组小鼠试验7天、 第8天全部处死，分离肿瘤、称体重；艾氏腹水瘤小鼠连续试验观察死亡时间。本酶对S180 30．3％、42．4％，高剂量组的生命延长率高于5一Fu组的33．93％。试验中5一Fu治疗组小鼠出 现活动减少、反应迟钝、进食减少、增重减慢；口服本酶的小鼠均未出现明显的毒付反应： 小鼠活跃、毛色光亮、进食正常，体重增加无异常，白细胞数与分类无异常。 全国农业生化与分子生物学会第八次学术研讨会论文集 人肝癌细胞Huh7接种5周龄雄性裸鼠BALB／cAnNCrj—flu共30只。次日起，试验组灌 试验第28天，全部裸鼠乙醚麻醉处死，完整地摘取肿瘤、脾、胸腺。称重。试验结果表明， 本酶对肝癌的抑制率为：低剂量组46．08％(与对照组比较p=0．026)，中剂量组57．52％(与 对照组比较p=O．002)。试验中裸鼠对蚯蚓纤溶酶无不良反应，三组裸鼠摄食、活动、体重 的增加以及脾脏、胸腺的重量没有显著差异。 4蚯蚓纤溶酶抑瘤机理的探讨 为阐明蚯蚓纤溶酶的抑瘤机理，试验中用流式细胞仪检测、荧光(AO／EB)染色一镜检、 例明显上升、s期比例下降；2．随着本酶浓度增加、肿瘤细胞凋亡率升高，呈剂量依赖性； h．，提取细胞DNA：琼脂糖凝胶电泳，观察到凋亡 3．本酶4uku／ml作用胃癌MGC803细胞48 细胞产生的、典型的以180bp为单位的DNA梯状条带。 用免疫细胞化学染色法检测本酶对癌细胞的p53蛋白表达的影响：本酶作用于胃癌 MGC803细胞48h．后，突变型p53蛋白表达显著减少，平均光强度从对照组的2．2880±0．41 学差异(P0．01)。 5小结 我们的初步研究表明： 1．蚯蚓纤溶酶是赤子爱胜蚓抗肿瘤的有效成分。2．蚯蚓纤溶酶对多 种肿瘤细胞具显著的抑制作用，抑制率与纤溶酶浓度呈量效依赖关系。3．蚯蚓纤溶酶对红自 血病K562细胞具显著的抑制作用，并呈剂量依赖性。本酶在极低浓度并不会刺激K562细胞 的增殖，这可能归结为几种同工酶对肿瘤细胞共同作用所产生的互补与增效效应。 4．小白鼠、裸鼠口服蚯蚓纤溶酶可显著