耐药性白假丝酵母菌主动外排泵基因过度表达和转录调控机制的研究.pdfVIP

耐药性白假丝酵母茵主动外排泵基因 过度表达与转录调控机制的研究 夏忠弟 郭慧君 (中南大学湘雅医学院微生物学系湖南长沙410078) 白假丝酵母菌，又称白色念珠菌，是I临床上最常见的机会致病性真菌，正常情况下对人 体无害，但在免疫低下或缺陷的人群中，白假丝酵母菌可引发浅表感染或甚至威胁生命的系 统性感染。近年来，随着爱滋病流行，广谱抗生素的滥用j癌症病人接受放疗、化疗，免疫 抑制药物在器官移植病人中的应用，白假丝酵母菌机会性感染率显著上升。唑类药物尤其是 氟康唑因其良好的生物利用度和安全性被广泛应用于临床，但长疗程、大剂量、反复使用唑 类药物导致了耐药性的发生而使临床治疗变得棘手。 白假丝酵母菌对唑类药物的耐药机制中最重要的一点就是：其细胞膜上的药物外排泵蛋 白过度表达，使药物外排能力增强而导致药物在白假丝酵母菌细胞内聚集减少。目前证实白 假丝酵母菌细胞内至少有两种与耐药性相关的药物外排泵蛋白：一类是Mdrlp，另一类是含 ATP结合盒的转运蛋白，白假丝酵母菌中这类转运蛋白统称为白假丝酵母菌耐药蛋白 (Candida albicansdrug 和Cdr2p与唑类耐药相关，其编码基因分别为CDR!和CDR2。 - 本研究的目的是想阐明白假丝酵母菌对唑类药物的耐药性与主动外排泵基因过度表达 的关系，并初步探讨主动外排泵基因过度表达的转录调控机制。 首先用微量稀释法测定4种抗真菌药物对40株临床分离的自假丝酵母茵的最低抑菌浓 度(MIC)，筛选出对唑类药物耐药的临床菌株；荧光染料罗丹明6G与唑类药物同为主动 外排泵的作用底物，它可以作为示踪剂来研究Cdrlp和Cdr2p的外排泵功能，通过检测罗丹 明6G在敏感和对氟康唑耐药的白假丝酵母菌中的外排情况，筛选出罗丹明6G外排明显增 加的耐药菌株；然后用RT-PCR方法检测主动外排泵基因CDRl和CDR2的相对表达水平； 最后用EMSA法检测与CDRl基因表达上调有关的转录调节因子与药物反应元件(drug responseelement，DRE)的结合活性。本研究根据CDRl基因5’末端调控区的基因序列， 设计含有DRE元件的21bp长序列作为探针，用生物素标记后与敏感和耐药的自假丝酵母菌 核蛋白共同孵育，经PAGE胶电泳分离和化学发光检测即可判断核蛋白中是否存在能与该探 针结合的转录因子，以及确定敏感株和耐药株中此种转录因子的结合活性有无发生改变。如 果待测蛋白质溶液中含有能与DRE元件结合的DNA结合蛋白，则会在相应的样品泳道中 形成一条较游离探针DNA片段条带滞后的带型，且条带强度会随着结合活性的增强而增强， 同时相应的游离探针DNA条带强度减弱。为验证DNA与蛋白结合的特异性，可进行竞争 性抑制试验，即在结合反应体系中加入过量的未标记探针，与标记的特异性DNA片段竞争结 合蛋白。其结果将导致特异性的滞后带的消失。 结果显示：①40株临床分离菌中，所有菌株对两性霉素B均敏感；对氟康唑耐药的有ll 唑的白假丝酵母菌中，有5株对罗丹明6G的外排明显增加，与敏感株比较，有显著差异性 (P《0．01)。而在这些菌株中，CDRl和CDR2基因的相对表达水平与敏感株比较，也显著增 高(P0．01)。③在白假丝酵母菌中，存在着一种可以与DRE元件结合的核转录因子；在5 株CDRl基因过度表达的白假丝酵母菌中，有3株其DRE一核转录因子复合物的结合活性较敏 感株增高。 上述结果表明在对氟康唑耐药的白假丝酵母菌中，由于主动外排泵基因CDRI和CDR2 的过度表达而导致耐药，而本研究中所使用的罗丹明6G外排的测定方法，能在临床菌株中 有效筛选出主动外排泵基因过度表达的耐药菌株。CDRI基因的过度表达是因为在这些菌株 中，位于基因启动子区的DRE调节元件与转录活化因子的结合活性增强而使转录水平增加。 至于与DRE元件结合的转录活化因子具体是哪一种?引起DNA一蛋白质结合活性增强的原 因是什么?这些问题还有待于更深入的研究和探索。 本研究为白假丝酵母菌耐唑类药物的机制提供了新的理论依据，并为抗真菌药物的研制 提供新的作用靶位，对开发泵抑制性抗真菌药物以逆转耐药具有重要的指导意义。 老年患者呼吸机相关性肺炎的病原菌及耐药性调查 徐正富‘石玉玲’