实验——PCR.pptVIP

基本PCR技术 质粒的三种构型和电泳结果 有时仅能看到两个条带。 本实验用的pUC19质粒，大小为 2686bp。 实验原理 在PCR反应体系中主要含有下列成分： 模板DNA； 寡核苷酸引物； dNTP（ATP、CTP、TTP、GTP四种核苷酸的混合物）； 高温DNA聚合酶（常用Taq酶）； Mg2+ PCR的基本反应步骤： 变性 退火 延伸 反应最终的DNA 扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。 实验原理 PCR的基本反应步骤： 变性 退火 延伸 实验原理 本实验所用的2?Taq混合物，主要成分是： 0.1 UTaqDNA聚合酶 500 μM dNTP 20 mM Tris-HCl (pH 8.3) 100 mM KCl 3 mM MgCl2 蓝色染料 其它稳定剂和增强剂 本实验所用引物，是按照大肠杆菌腺苷脱氨酶的基因设计，该基因的长度约1 kb。 操作步骤 待检DNA模板的准备：取一干净离心管，加入99 ?L ddH2O，再加入自己小组所提取的K12s基因组1 ?L，使其稀释至1/100。 PCR反应混合液的配制：取4个200 ?L离心管进行编号，1＃管为阳性对照管；2＃管为阴性对照管；3＃、4＃管为反应管。 在1＃管内，按照顺序加入下列成分（单位：?L）： dd H2O 7.5 引物P1 1 引物P2 1 阳性对照模板PT 0.5 2?Taq混合物 10 总体积 20 2＃管内，以等体积ddH2O代替阳性对照模板； 3＃、4＃管内，以等体积待检DNA模板代替阳性对照模板，分别加入各试剂。 操作步骤 PCR反应：将上述PCR小管插入PCR仪内，按下列程序运行： 94℃预变性5min 30个循环（94℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸80 s） 72℃延长5 min。 结果检测：从4个反应小管内各取PCR扩增产物10 ?L，在1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。 注意事项 每吸取一个试剂，都要更换枪头，防止溶液的污染。 避免PCR反应体系的污染。 加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回冰浴。 往PCR中加入新的试剂时，把枪头伸入液面以下，反复吹吸以使溶液混合。 注意EB的毒性，小心避免污染。 思考题 PCR技术的原理是什么？ PCR过程中，DNA的扩增是否可以无限进行？ 下次实验 DNA分子的限制性内切酶消化、片段纯化、连接 * cccDNA: covalently closed circular DNA * 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 * * * * * * * * cccDNA: covalently closed circular DNA * 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 * * * * * * *