动物胚胎工程yyd转基因动物.pdf

第九章 转 基 因 动 物 转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究 中的突出成果。 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学 遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究 等多方面做出了很大的贡献。 （一）转基因动物的概念 转基因动物（transgenic animal ）是指以实验方法导入的 外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类 动物。 外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种 动物叫转基因动物。 严格说，转基因动物有别于嵌合体。 嵌合体动物（chimeric animal ）：只有部分组织细胞的基因组 中整合有外源基因。 逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制 备的动物第一代均为嵌合体。雄原核显微注射法制备的动物第 一代中1-10%为嵌合体（延迟整合）。 Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段 的重组质粒DNA 以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原 核内，得到了带有这种外源DNA顺序TGM 。 1982年Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”, 曾 引起整个生物学界的轰动。 到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、 牛等等大小动物。 从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤 学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究， 基因治疗的开发研究等。 （二）转基因动物的制作方法 1、受精卵雄原核显微注射法 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 3 、逆转录病毒感染法 4、体细胞核移植法 5、精子载体法 1、雄原核显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术 将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原 核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵 管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 这一方法的实验程序如下： （1）准备假孕母鼠（养母） （2 ）受精卵的准备 （3 ）基因导入 （4 ）胚胎移植 （5 ）对幼鼠的鉴定 Expression of Exogenous Genes 筛 选 方 法 Southerns, Induction/Loss of Restriction sites, PCR RT-PCR 测定表达产物活性：ELISA，RIA 其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的 时间。 基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点 中。外源基因的插入会引起宿主基因的DNA序列 重排，缺失，重复或易位。 外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在 表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清 楚。 优点： 外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过 程直观； 整合率高 缺点： 设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜 能细胞系。 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产 生嵌合体及转基因动物。 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以 形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件 下表现出不同的功能状态。 在ES细胞上的基因操作： 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙 共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。 因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基 因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了 某种基因功能的动物后代。 Generating ES Cells Screening ES Cell Clones Screening Plate - Grow for