血清中低分子量蛋白质的提取和鉴定.pdfVIP

V01．3l 高等学校化学学报 No．10 CHEMICAL0FCHINESE 1955一1960 2010年10月 JOURNAL UNlVERSmES 血清中低分子量蛋白质的提取和鉴定 李铁纯1”，汪子明1，王璐1，张寒琦1，于永3 (1．吉林大学化学学院，长春130012；2．鞍山师范学院化学系，鞍山11加0r7： 3．吉林大学仪器科学与电气工程学院，长春130061) 摘要采用改进的圆盘凝胶电泳提取人血清中低分子量蛋白质，去除了血清中分子量大于3×104的蛋白质， 将提取的低分子量蛋白质热变性后直接在溶液中酶解成肽，经液相色谱-质谱分析，并进行Mascat数据库检 索，确认出人血清中97种蛋白质． 关键词血清；低分子量蛋白；液相色谱串联质谱；圆盘凝胶电泳 中图分类号0657 文献标识码A 文章编号0251聊90(2010)10．1955舶 血清是人体中非常复杂的体液，它不仅含有丰富的蛋白质，也含有脂肪、维生素及矿物质等小分 子物质，它所含有的蛋白质除了血液本身的蛋白质，还有与人体各组织器官相关联的蛋白质．据估计， 血清中包含上万种蛋白质和多肽，它们的浓度范围从(35～50)×109pg／mL到0—5pg／mL…．血清蛋 白质中已经鉴定有22种高丰度的蛋白质，这些蛋白质占血清中所有蛋白质的99％【2J，而其余的l％为 低丰度、低分子量蛋白质，而一些疾病很可能与体液中低分子量蛋白质有关【3q]．为了研究这些低分 子量蛋白质，必须消除高丰度、高分子量蛋白质，尤其是血清白蛋白和免疫球蛋白的干扰．去除这些 高丰度、高分子量蛋白的主要方法包括亲和去除和超滤膜过滤等一“4|．表面增强激光解析飞行时间质 子蛋白质‘151． 亲和去除法在去除高丰度蛋白质的同时也会去除一些低分子量蛋白质，超滤膜过滤一般能够截留 大约95％的高分子量蛋白质，而透过膜的高分子量蛋白质仍然会对低丰度、低分子量蛋白的鉴定产生 干扰，并且膜也会吸附蛋白质，造成低分子量蛋白质的损失．使用sELDI-TOF．MS时，只能测定与所用 功能性探针相互作用的低分子量蛋白质，而不是全部低分子量蛋白．我们提出了一种简单的提取血清 中低分子量蛋白质的圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳法¨6。，本文则将这一方法用于提取血清中低分子量蛋 白质，不经分离而直接酶解，然后通过高压液相色谱(HPLC)／Ms／Ms进行鉴定，为血样中低分子量蛋 白质的提取和鉴定提供了一种简便的方法． 1 实验部分 1．1材料与试剂 健康献血者的血清样品由鞍山市中心医院提供；电泳级十二烷基磺酸钠(SDS)由香港Farco化学 供应商提供；三羟甲基甘氨酸(％s)和三羟甲基氨基甲烷(嘶cine)均购于国药集团；丙烯酰胺和甲叉 双丙烯酰胺均购于天津化学试剂研究所；HPLC级乙腈和甲酸均购于迪马公司；序列级胰蛋白酶购于 普洛麦格公司；水经过MiUi-Q系统纯化． 1．2缓冲液的配制 1．2．1 mL 样品缓冲液 将lmL甘油、0．5 SDS和10．5啪L／L的％s—HCl混合 mLp-巯基乙醇、0．4g 后，加少量溴酚蓝，然后用水定容至5mL． lnL水中溶解24．22 1．2．2阳极缓冲液在50 g％s，用浓盐酸调整pH=8．9，然后定容至100mL， 收稿日期：20lOJ03J吣． 联系人简介：于永，男，博士，讲师，主要从事分析仪器与分析方法研究．E．mail：”·y硼g@jlu．edll．∞ 万方数据 1956 高等学校化学学报 V01．3l 0．45斗m滤膜过滤，于4℃保存，用时稀释10倍． 1．2．3 阴极缓冲液在50mL水中溶解12．1lg％s、17．96g腽cine以及lg电泳级SDS，直接定容 至100 mL，o．45斗m