麦清蛋白的初步提取实验报告.docVIP

实验四：麦清蛋白的初步提取 研究背景及目的 在一定程度上讲，生物学的发展是随着对生物大分子物质研究的不断深入进行的。生物大分子的深入研究必然对物质纯度的要求不断提高，在原有纯化技术达不到所需纯度要求的情况下，必然会有新的纯化技术被催生，由此众多的纯化技术被发明和利用。在这些技术中，层析技术自被发明以来一直以其独特的优势始终占据着生物大分子纯化的主导地位，并且仍在进一步发展壮大。[1] 本实验以分子筛层析完成麦清蛋白脱盐为实例验证层析技术的可行性，了解相关技术的应用及新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用，感悟技术发明的思路。 原理 本实验选取广泛用于生物大分子纯化的分子筛层析技术完成麦清蛋白的脱盐从而来研究层析技术。分子筛层析又叫凝胶过滤层析，凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶柱内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离纯化的目的。实验选取麦清蛋白为纯化对象进行研究，为了排除次要的影响因素、便于检测纯化结果，我们首先通过盐析法对小麦种子提取液做初步的提纯，得到麦清蛋白与硫酸铵的混合物，然后通过分子筛层析除盐，最后利用紫外分光光度计测定各阶段纯化产物的OD280以检测蛋白含量，同时用BaCl2检测纯化产物中有无硫酸根离子从而鉴定纯化效果。 材料、仪器与试剂 材料： 新鲜小麦种子 葡聚糖凝胶G-25 仪器： UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司，编 TPL-4OB低温台式离心机（上海安亭科学仪器厂，编 BSZ-100自动部份收集器（上海沪西分析仪器厂，编 高压万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司） JP-100架盘药物天平（美国双杰兄弟有限公司，编号3878） 配平天平（北京医用天平厂）HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂） 层析柱（上海锦华层析设备厂）大龙系列加样器及吸头 试管，离心管，三角瓶，滴管，滤纸 试剂： 饱和硫酸铵、1%氯化钡 操作步骤 溶胀凝胶 称取葡聚糖凝胶G-25适量，加入足量的蒸馏水或洗脱液于沸水浴中溶胀5h。 溶胀平衡后，适度搅拌使充分悬浮后稍静置，待大部分凝胶沉降后，除去含有细碎颗粒的上层液，如此反复操作多次直至无细微颗粒为止。最后将漂洗好的凝胶在真空干燥器中减压除气。 装柱 打开层析柱柱帽，下端止水，装入1/4左右柱长的磷酸盐洗脱液。将凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开启洗脱，使凝胶一直处在溶液中，一次性连续装柱直至柱长的3/4左右。装柱完成后适时止水以使洗脱液面高于凝胶面3~5cm，待凝胶沉降完成后，旋上柱帽，连接洗脱系统，平衡洗脱约3h。 分离提取麦清蛋白 取小麦种子，粉碎，称取2g于三角瓶，加20ml蒸馏水，连续震荡60min， 3000rpm离心20min取上清液，搅拌下加入等体积的饱和硫酸铵溶液，冰箱冷藏4小时左右使麦清蛋白全部盐析沉淀出来。盐析充分后以3000rpm离心20min，弃上清，加2.5ml去离子水溶解沉淀，即得麦清蛋白与硫酸铵混合液。 上样 打开柱帽，放入略小于层析柱内径的滤纸片，使其自然飘落在凝胶面上。连接收集系统，确定流速（6滴/min），准备上样。利用恒流泵加速按钮使洗脱液面与胶床表面相切甚至相齐时，停止洗脱。用加样器取1.5ml样品提取液，小心滴入凝胶床面中央，然后开启洗脱，同时开启收集器。待样品与凝胶面相齐时，迅速用滴管加入略高于上样高度的洗脱液，如此操作两次。待洗脱液再次与凝胶面相齐时，用滴管小心加入3~5ml高洗脱液层，旋上柱帽，连续洗脱收集。 收集与鉴定 每3毫升收集一管，然后用紫外分光光度计测OD280。记录每管的消光值，以管号为横坐标，消光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。比色完毕后，各管分别加2滴1%的BaCl2溶液，混匀观察是否产生白色沉淀。 数据整理 实验数据如下表： 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 OD280 0.111 0.032 0.025 0.026 0.025 0.027 0.170 1.432 0.503 沉淀 无 无 无 无 无 无 无 无 无 管号 10 11 12 13 14 15 16 17 18 OD280 0.159 0.111 0.116 0.100 0.096 0.083 0.077 0.072 0.064 沉淀 无 有 有 有 有 有 无 无 无 结果计算与分析 根据上表中的数据，以管号为横坐标、OD280为纵坐标，绘制洗脱曲线如下： 根据洗脱曲线，我们看到：蛋白质被收集于7-10号管中，其中7号、10号管中含量很少，8号为峰值管