PathScanreg;夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）抗体配对方案.docVIP

PathScan?夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）抗体配对方案所需试剂: 包被（缓冲）液：1X PBS，（20X PBS #9808） 3.2 mM Na2HPO4，0.5 mM KH2PO4，1.3 mM KCl，135 mM NaCl，pH 7.4 漂洗（缓冲）液：1X PBS / 0.05% Tween-20，（20X PBST #9809） 封闭（缓冲）液：1X PBS / 0.05% Tween-20，1% BSA 1 X细胞裂解液：（10X Cell Lysis Buffer #9803）短时间内这种溶液可以放在4°C（1- 2个星期）注意：CST建议在使用前添加1mM苯甲磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF） 20 mM Tris (pH 7.5) 150 mM NaCl 1 mM ethylene diamine tetraacetate (EDTA) 1 mM ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) 1% Triton X-100 2.5 mM sodium pyrophosphate 1 mM β-glycerophosphate 1 mM Na3VO4 1μg/ml leupeptin TMB 底物：(TMB Substrate #7004) 反应终止液：(STOP Solution #7002) 注意：这些试剂需现配现用。包被流程： 用水漂洗微孔板。每孔加200 μl水然后倒掉。反扣在纸巾上务必将液体吸干。 将捕获抗体按1：100用PBS稀释。为一块96孔板准备10 ml稀释抗体：在9.9 ml PBS中加入100 μl捕获抗体原液。混匀后，每个孔加100 μl。封好后4°C孵育过夜（17-20小时）。 在包被过夜后，轻轻撕去封膜，清洗各孔： 将板中的溶液倒入废液缸中。 用漂洗液洗4次，每次每孔200μl。每次清洗时，将微孔板用力扣在干净纸巾上，弃净所有液体，但注意不要让微孔板完全干掉。 用无尘纸擦拭所有孔的外底面 封闭微孔板。每个孔中加入150 μl封闭液，盖好板后37°C孵育2小时。 封闭后，按步骤3洗板。洗好后微孔板就可以用了。 制备细胞裂解物 吸去培养基。换上添加有调节因子的新鲜培养基，处理所需时间。 在非变性条件下收集细胞，去除培养基并用冰冷的PBS漂洗一遍。 除去PBS，每个10 cm盘中加入0.5 ml冰冷的含1 mM PMSF的1X细胞裂解液，冰上放置5分钟。 将所有细胞刮下，转移至合适的离心管中。继续放在冰上。 在冰上对样品进行超声处理。 4°C离心10分钟，将上清转移到一个新管中。上清即为细胞裂解物。分装成足够一次使用的若干份保存在–80°C。 测试流程： 未稀释或在封闭液中稀释的细胞裂解物都可以用于实验。每孔加入100 μl细胞裂解物。盖上板并在37°C孵育2小时。 洗板如涂覆操作第3步。 将检测抗体1：100稀释在封闭液中。每块96孔板准备10 ml稀释抗体，在9.9 ml PBS中加入100 μl的检测抗体原液。混匀后，每孔加入100 μl。盖好板后37°C孵育1小时。 洗板操作同包被流程第3步。 HRP偶联抗小鼠或抗兔的二抗用封闭液按1：1000稀释。每块96孔板准备10 ml稀释抗体，在9.99 ml PBS中加入10 μl的二抗原液。混匀后，每孔加入100 μl。盖好板后37°C孵育半小时。 洗板操作如包被流程第3步。 每孔加入100 μl T MB底物。盖好后37°C孵育10分钟。 每孔加入100 μl STOP溶液。 在适当的微孔读板仪上测定各孔在450 nm处的吸光值。