广州大学城各校区空气微生物的多样性鉴定 实验方案.docVIP

实验广州大学城各校区空气微生物的多样性鉴定 一、目的要求 1. 掌握平板菌落成像技术革兰氏染色的方法。 2. 熟练应用革兰氏染色的方法进一步分型鉴定空气微生物。 3. 结合实验2的计数结果，综合评价广州大学城各校区空气微生态安全性。 二、基本原理 1. 平板与菌落成像 采用Tanon凝胶成像系统，选择白（黑）板和白光，调节焦距可以对平板进行整体成像，也可对菌落进行放大成像。 2. 革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain)?。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 Tanon凝胶成像系统；实验二培养的总菌平板和真菌平板；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。 四、操作步骤 （1）平板与菌落成像 采用Tanon凝胶成像系统，选择白（黑）板和白光，调节焦距可以对平板进行整体成像，也可对菌落进行放大成像，放大倍数根据菌落清晰度和形态可判定性确定。 （2） 革兰氏染色法 1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 2. 干燥 室温自然干燥。 3. 固定 固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。 4. 染色 （1）简单染色法： ① 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。 ② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。 ③ 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 ④ 镜检 涂片干燥后镜检。 （2）革兰氏染色法： ① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。 ② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。 ③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。 ④ 复染 用番红液染1～2min，水洗。 ⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 (3) 混合涂片法： 按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、结果与分析 （1）平板成像结果 （2）菌落成像结果与形态聚类（参考附件1） （3）革兰氏染色与相似染结果聚类（参考附件2） 六、讨论 （1） 广州大学城各校区空气微生物的多样性与空气微生态安全性评价