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常用细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法） 三、线粒体膜势能的检测 四、DNA 片断化检测 五、TUNEL 法 六、Caspase-3 活性的检测 七、凋亡相关蛋白TFAR 19 蛋白的表达和细胞定位分析 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋 亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2 ） 染色细胞： 用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核 膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI 。三种种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA 的A-T 碱基区。紫外光 激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst 是与DNA 特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml 的浓度，使用时 用PBS 稀释，终浓度为10 ug/ml 。 DAPI 为半通透性，用于 规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1mg/ml 的浓度， 使用终浓度一般为10 ug/ml 。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹 状 （rippled ）或呈折缝样 （creased ），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa 期细胞核的染色质高度 凝聚、边缘化；Ⅱb 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电 显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei ）的细胞 核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations ）的空泡结构( 图2) ；Ⅱa 期细胞 核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 1 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V 法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS ）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期， PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中( 图3) 。Annexin-V 是一种 分子量为35~36KD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素 （FITC、PE ）或biotin 标记，以标记了的Annexin-V 作为荧光探针，利用流式 细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中 晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使 用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法 1 悬浮细胞的染色：将正 培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1 106 ）用PBS 洗2 次， 加入100ul Binding Buffer 和FITC 标记的Annexin-V （20ug/ml ）10ul ，室温避光30min，再 加入PI （50ug/ml ）5ul，避光反应5min 后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan 进 行流式细胞术定量检测 （一般不超过1h）， 同时以不加AnnexinV-FITC 及PI 的一管作为阴 性对照。 2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 结果 [ 图4 、图5] 注意事项 1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。 2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。