组织制片技术原理与流程及切片机的使用.docVIP

组织制片技术原理与流程及切片机的使用 组织制片的特点 组织制片是组织学、胚胎学、病理学、生物学等学科观察和研究组织、细胞的正常形态和病理变化的常用方法。其基本原理是用固定剂固定组织、细胞以及各种亚细胞器，保持组织的微细结构，制成薄片，并用不同的染色方法增加各部分的色差，在显微镜下观察组织、细胞的形态结构，或利用化学或物理方法显示组织、细胞内的某些化学成分，并可进行形态和化学成分的定量分析。随着细胞和分子生物学技术的发展，组织制片也为原位显示细胞内基因表达提供了基础。 一 石蜡包埋切片制作 石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂，故固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水，后用二甲苯等透明剂置换出乙醇，此过程即脱水、透明。再用石蜡渗入组织块，冷凝后变硬，即浸蜡、包埋，就可在切片机上切片了。 固定 细胞、组织离体后要迅速用相应的固定剂固定，使蛋白质沉淀、变性、凝固，保持组织原有的形态结构和抗原性。一般用多聚甲醛、FAA、丙酮或Carnoy于4℃并向固定过夜。 脱水与透明 固定后的组织须由低浓度到高浓度的乙醇逐级脱水，一般为50%、70%、85%、95%、和100%（3次） 渗蜡与包埋 渗蜡是石蜡置换组织块中透明剂的过程，一般用熔点为52-60℃的石蜡。透明后的组织块先于1/1体积的二甲苯与石蜡中37℃渗透过夜，后温度调至58℃换入纯石蜡继续渗透，一般每间隔3h换一次纯石蜡，直到无二甲苯 气味即可进行包埋。 切片与展片 先用刀片修去组织块周围多余的石蜡，一般保留2mm左右的石蜡，修整成梯形的组织块，以便于展片时蜡带的分离。先加热刀片，后把修好的组织块快速粘到方形的小木块上，冷凝后即可进行切片。 一般组织切片的厚度为6-12um，切片速度以40-50次/min为宜，用毛笔托起蜡带，分割后依次放到洁净的载玻片上，蜡带的光滑面朝下放，后滴上适量的蒸馏水放至展片台上于37-40℃烤片过夜。 5. 染色、脱水、透明与封片 染色一般是双重染色或单染，番红与固绿是常用双重染色法，而苏木精是最优良的核染色剂。具体流程如下所示： 番红-固绿双重染色法： 纯二甲苯（20min）→纯二甲苯（20min）→1/2酒精+1/2二甲苯（2-3min）→100%酒精（2-3min）→95%酒精（2-3min）→85%酒精（2-3min）→75%酒精（2-3min）→50酒精（2-3min）→番红染液（30-1h）→50%酒精（30s）→75%酒精（30s）→85%酒精（30s）→95%酒精（30s）→固绿染液（7s）→95%酒精（30s）→100%酒精（30s）→1/2酒精+1/2二甲苯（30s）→纯二甲苯（30s）→纯二甲苯（30s）→风干→封片→镜检拍照 素木精单染法：二甲苯脱蜡至蒸馏水→4%铁矾（20min）→水洗4-5次（5min/per）→ 蒸馏水数次（2-3min/per）→0.5%苏木精（30min）→水洗去余色→2%铁矾分色→流水冲洗（30-60min）→50%酒精（2h）→70%酒精（1h）→85%酒精（2h）→95%酒精（20s）→100%酒精（1-5s）→100%酒精（5s）→1/2酒精+1/2二甲苯（5s）→二甲苯（5s）→二甲苯（5s） →通风橱风干→中性树胶封片→镜检 番红(safranin)染色液：碱性染料，染木化、角化、栓化细胞壁及染色体、核仁等。 (1)番红水溶液： 配方：番红1 g；蒸馏水100m1 用于临时制片染色，可使木质化、栓质化的细胞壁及细胞核染成红色。 (2)番红酒精溶液： 配方：番红0.5g或1g；50％酒精100ml 在植物永久制片中常与固绿、亮绿、苯胺蓝做二重染色，或与结晶紫、橘红G三重染色，可使木质化、角质化、栓质化的细胞壁及细胞核等呈现不同程度的红色，效果甚好。 固绿(fast green)染色液：又名快绿。酸性染料，使纤维素细胞壁和细胞质呈蓝绿色。染色快，通常10～30s即可，不易褪色。 配方：固绿0.5～l g；95％乙醇100m1 番红-固绿对染效果：根、茎、叶等组织切片染色后，番红使细胞核、木质化细胞壁呈鲜红色，角质化细胞壁呈透明粉红色，木栓化壁呈褐红色；固绿使细胞质和具纤维素的细胞壁呈蓝绿色。 苏木精(hematoxylin)染色液：天然染料，提取自苏木的心材。经其染色，因细胞中结构的不同而呈现不同深浅颜色——“多色性”，但由于苏木精与组织亲和力差，染色时需加金属盐媒染(如铁矾)。 配方(铁矾-苏木精)：甲液：苏木精0.5g；蒸馏水100ml 乙液：硫酸铁铵(铁矾)2～4g；蒸馏水100ml 可进行细胞学、胚胎学染色，使细胞分裂时期的染色体呈深蓝色，细胞质呈浅蓝色，细胞壁介于二者之间。色泽保持长久。 二 树脂包埋切片制作 树脂包埋