菠菜胆碱单加氧酶基因cDNA克隆及重组植物表达载体构建.pdfVIP

菠菜胆碱单加氧酶基因 cDNA 的克隆及重组植物表达 载体的构建1 柳娜 1，2 ，王蒂 1，2 ，司怀军2，3 1 甘肃农业大学农学院，兰州（730070 ） 2 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州（730070 ） 3 甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州（730070 ） E-mail ：wangd@ 摘 要：从菠菜叶片中提取总RNA ，用RT-PCR 方法扩增到菠菜胆碱单加氧酶（CMO ）基 因 cDNA ，然后将CMO cDNA 克隆至pBluescript SK+ 载体上，序列分析结果表明该CMO cDNA 全长为 1424 bp，开放阅读框1320 bp，编码440 个氨基酸。核酸序列同源性分析表明， 该cDNA 与已发表的菠菜CMO 基因具有99.8% 同源性，氨基酸序列同源性达99.6%。在此 基础上以pBI121 和pBIrd 为基础，构建了组成型启动子CaMV 35S 和逆境诱导表达启动子 rd29A 驱动的CMO 基因的植物表达载体。 关键词：菠菜；胆碱单加氧酶基因；克隆；表达载体构建 干旱和盐碱是影响植物生长发育最主要的非生物胁迫因子，许多植物对干旱和盐碱比较 敏感，缺乏有效的抗旱机理，从而造成作物产量的严重损失。但某些高等植物在盐、干旱等 渗透胁迫下，可以大量合成并积累甜菜碱作为无毒的渗透调节剂，起着调节渗透压，保护胞 [1] 内酶活性的作用。甜菜碱是甘氨酸的衍生物,被认为是最好的渗透调节剂 。 在高等植物中，甜菜碱经两步酶催化得到，即胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱，催化第一步反 [2-3], 催化第二步反应的酶是甜菜碱 应的酶是胆碱单加氧酶（choline monooxygenase，CMO ） [4-6]，这两种酶是控制甜菜碱合成的两个 醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase, BADH ） 关键酶。Rathinasabapathi 等[7]首先从菠菜叶片中克隆了 CMO 的完整 cDNA ，该 cDNA 全 [8] [9] 长 1622 bp。随后，藜科的甜菜 、山菠菜 CMO cDNA 全序列也被克隆并分析其序列，发 现不同植物之间 CMO 基因及氨基酸序列同源性较高。本研究从菠菜叶片中克隆了 CMO 基 因，并构建了组成型启动子 CaMV 35S 和逆境诱导表达启动子 rd29A 驱动的 CMO 基因的植 物表达载体，以进一步转化农作物，提高其抗旱耐盐能力。 1. 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 植物材料、质粒和菌株 菠菜（Spinacia oleracea L. ）种子来自市场销售的种子，种植于温室内；质粒pBluescript SK+ 、pBI121 （含CaMV 35S 启动子）、pBIrd （含rd29A 启动子）由实验室司怀军老师提供； 大肠杆菌为 DH5α。 1.1.2 主要试剂 Trizol 试剂盒、反转录试剂盒、各种限制性内切酶、PyrobestTM DNA 聚合酶、Taq 聚合 酶、X-gal 、IPTG、T4 DNA 连接酶均购自 TaKaRa 公司；凝胶回收试剂盒购自鹏程公司。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金项目（20050733003 ）和甘肃省农业生物技术研究与应用开 发项目（GNSW-2006-01 ）的资助。 -1- 1.1.3 培养基和培养条件 大肠杆菌培养基为 LB