EBP50影响Hela细胞微丝骨架分布.pdfVIP

EBP50影响Hela细胞微丝骨架的分布* 1 1 1,2 1 郑君芳 , 王瑛 , 陈鹏 , 贺俊崎 1.首都医科大学基础医学院，生化和分子生物学系，北京(100069); 2. 山东省眼科研究所，山东青岛（266071) E-mail: jq_he@ 摘 要：目的：研究与膜-细胞骨架连接蛋白(ezrin-radixin-moesin, ERM)家族相结合的磷酸化 蛋白50 (ERM-binding phospho-protein-50, EBP50)对Hela细胞微丝骨架的影响，进而阐明其影 响肿瘤细胞生长迁移的分子机制。方法 将pBK-CMV-HA和pBK-CMV-HA-EBP50wt质粒分 别稳定转染人宫颈癌Hela 细胞系，利用免疫荧光细胞化学染色结合光镜和激光共聚焦扫描显 微镜分别观察和分析两组细胞微丝骨架的含量及分布的异同，及使用10ng/ml和20ng/ml血小 板源性生长因子PDGF （platelet-derived growth factor ）刺激15min后两组细胞微丝骨架定位的 变化。结果：转染的外源性EBP50 cDNA 片段成功整合到Hela 细胞基因组中。与转染空载 pBK-CMV-HA 的Hela细胞相比，EBP50对Hela细胞微丝骨架的含量和分布没有明显影响，但 在PDGF刺激下，EBP50 能够与微丝骨架一起迁移至膜上，并共定位。结论：在受到PDGF 刺激时，EBP50能够通过影响Hela细胞中微丝骨架的分布，来发挥其影响细胞的生长和迁移 的功能。 关键词：微丝骨架；Hela 细胞；EBP50 中图分类号：R331.3 文献标志码：A 与膜-细胞骨架连接蛋白家族结合的磷酸化蛋白50 (ERM-binding phosphoprotein-50, EBP50 ，NHERF, NHERF1)是最近发现的一种具有抑癌潜能的多功能连接蛋白，在细胞的生 长、趋化和迁移过程中起着非常重要的作用。但是各个研究组报道的EBP50对细胞的生长和 迁移能力的影响并不一致[1-5] 。微丝骨架是肌动蛋白(actin) 以非共价键结合形成的纤维型多聚 体F肌动蛋白。微丝骨架在细胞分化和运动时会发生重组，而且它还可能起着介导胞外信号 分子的作用[4,6,7] 。EBP50抑制细胞生长、趋化和迁移的功能可能是通过影响微丝骨架来达到 的。因而，本研究利用免疫荧光细胞化学染色结合光镜和激光共聚焦扫描显微镜观察和分析 转染EBP50重组质粒和空载体的Hela细胞微丝骨架的含量及分布的异同，及PDGF刺激后两 组细胞微丝骨架定位的变化，以探讨EBP50对细胞骨架的影响，阐明其影响细胞生长迁移的 分子机制。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、细胞株、质粒 菌株E.coli DH5α、细胞株Hela 、真核表达质粒pBK-CMV-HA 由本实验室保存。重组表 达质粒pBK-CMV-HA-EBP50wt为本实验室构建。 1.1.2 试剂 各种限制性内切酶购自Takara公司；Lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司；DMEM 培 养基、小牛血清及青/链霉素购自Hyclone公司；anti-β-actin抗体购自Sigma公司；anti-HA抗 体购自MBL公司；HRP标记的羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司；ECL化学发光试剂盒购自 Pierce Biotech公司；其他试剂均为国产分析纯。 ∗国家自然基金资助项目 ; 北京市教委重点基金资助项目(KZ200610025013); 新世纪优 秀人才支持计划(NCET-06-0184); 北京市优秀人才培养资助项目(20071D0501800253); 首都医科大学基础 临床合作课题(2007JL50) - 1 -