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哈茨木霉的原生质体形成与再生 肖荣凤, 刘 波*, 史 怀, 朱育菁 （福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003） 摘要：跟踪观察了哈茨木霉（Trichoderma harzianum）FJAT-9040的原生质体形成与再生情况。结果表明：培养12-14 h的新鲜哈茨木霉菌丝体在2 mL含20 mg/mL崩溃酶和溶壁酶的裂解液中，28 ℃、70 r/min酶解4 h时，原生质体可满足转化要求，数量达2×108个/mL，再生率为%。 关键词：哈茨木霉；原生质体；再生中图分类号: Q93995 文献标识码: A　Preparation and regeneration for protoplast of Trichoderma harzianum XIAO Rong-feng LIUu Bo* SHI Huai ZHU Yu-jing, (Agricultural Bio-Resources Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China) Abstract: Preparation and regeneration rate for protoplast of Trichoderma harzianum strain FJAT-9040 were investigated. Results showed that the optimum preparation conditions were: mycelium incubated for 12-14 h and mixed with 2 ml enzyme mixture containing 20 mg/mL collapse enzyme and wall enzymes, shaking at 70 r/min for 4 h at 28 ℃. The amount of protoplast was 2×108/mL and regeneration rate was10.1%. Key words: Trichoderma harzianum; protoplast; regeneration 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）对许多植物病原真菌具有很强的拮抗作用，如枯萎病原菌、黄萎病菌、灰霉病菌等[]。利用基因工程技术筛选优良生防工程菌及基因标记技术的研究菌株的生防机制，可提高菌株的生物防治效能。[4-6]。良好的原生质体制备率和再生率是进行原生质体融合与基因标记转化的关键因此，对具有良好生防潜能的哈茨木霉菌株FJAT-9040本研究对原生质体形成与再生进行了分析。1 材料与方法 1.1 材料 菌株：哈茨木霉菌株FJAT-9040由福建省农业科学院农业生物资源所提供。培养基：PDB培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、水1000 mL；再生半固体培养基：马铃薯200 g、蔗糖182 g、琼脂9 g、水1000 mL 。试剂：崩溃酶drislase，Sigma公司；溶壁酶lysing enzyme，广东微生物所； 0.8 mol/L NaCl；山梨醇溶液（STC，含1.2 mol/L 山梨醇、10 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl、50 mmo1/L CaCl2)；上述除标注产地的试剂外，其余均为国产分析纯。 1.2 方法.2.1 原生质体制备及形成过程参照肖荣凤等[]的方法，略作修改。菌株FJAT-9040在PDB培养液中培养5d后过滤获得孢子悬浮液。吸2mL FJAT-9040孢子悬浮液于PDB培养液中，28 ℃、150 r/min摇床培养12～14 h后用三层擦镜纸过滤收集菌丝，并用0.8 mol/L NaCl充分洗涤。取600 mg菌丝体分别加入50mL的离心管中，再加入2 mL含20 mg/mL崩溃酶和溶壁酶的裂解液，用枪头充分打散菌丝团，28 ℃、70 r/min消化1 h、2 h、2.5 h、3.0 h 、3.5 h和4 h分别取样镜检观察原生质体的形成情况并拍照，共处理12管，每个时间点取2管。用三层擦镜纸收集滤液，室温3500 r/min 离心10 min，弃上清液加20 mL STC溶液5000 r/min离心10 min，弃上清，根据沉淀的量，用适量的STC调节浓度，观察细胞壁保持完好原生质体形成量。 1.2.2原生质体再生取1.2.1中的培养(2.5-4.0)h的原生质体悬浮液经山梨醇溶液稀释后吸3 mL，加入到15 mL冷却至50 ℃左右的再生半固体培养基中，混匀后均分于3个底层已覆盖再生半