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维普资讯 · 86 · 微 生 物 学 通 报 。 i专论与综述i 、蠕 蠕 蠕 刊 培养过程对基因工程菌稳定性的影响 刘焉伟 郭 勇 华南理工大学食品与生物工程学院 广州 510640) 张 晨 (嘉应大学生物系 梅 闸514015) 摘要 ：重组质粒不稳定性是基 因工程菌生产中的主要 问题 ，从培养过程的角度综述 了选择压力、操作 方式、培养基组成、溶氧 、培养温度 、pH等因素对质粒稳定性 的影响，为基因工程菌的发酵提供参考 。 关键词 基 因工程菌，培养，质粒稳定性 中图分类号 ：Q93 文献标识码 ：A 文章编号 200])02—0086—04 包含质粒载体的细胞培养 的不稳定性是分子克隆技术商业开发应用中的主要 问题 。重组 质粒稳定性受多种因素影响，如寄主细胞的特性、质粒的类型和环境条件等。质粒的稳定性可 以通过构建重组质粒时的基因操作及培养条件优化加以提高。重组缺陷菌株作为克隆基因受 体菌、用不包含转座子的质粒 、使用温度敏感型质粒、调控环境参数对保持重组质粒稳定性有 利。对于一定结构的基因工程菌而言，优化环境条件可以提高稳定性 ，这对于基因工程产物的 生产具有重要 的意义 。 1 含调控型启动子的基 因工程菌稳定性控制 根据基因工程理论 ，重组质粒启动子如果为诱导型，则其活力受控于受体细胞的代谢。因 此 ，形成基因工程菌的阶段培养原则 ，即调控环境参数 (碳氮 比、pH、培养温度 、溶氧等)，于发 酵前期 ，保持受体细胞生长速率，提高受体细胞浓度，控制外源基因不大量表达，这能保证重组 质粒稳定地遗传 ；培养后期 ，适 当调控以提高质粒拷贝数 ，加强转录翻译效率 ，使外源基因高度 表达 已经采用的诱导方式主要有专一性物质的诱导和培养过程的温度诱导，诱导的时机非常 重要 研究重组酵母中克隆基因表达时发现在各种稀释速率下 ，质粒稳定性随LacZ基因表达 的诱导而降低。Kim等研究用基因工程大肠杆菌生产果糖转移酶时证明D碍L糖可代替有毒而 且 昂贵的 IPTG，是一个可供选择的合适 的诱导物 j。 2 选择性培养基提高质粒稳定性 为了提高含质粒细胞的竞争力 ，通常用选择性培养基进行培养。首先在表达产物的质粒上 引入抗生素抗性基因，再引入抗生素到培养基中，这对提高质粒稳定性非常有效，但对于大规 模生产系统 ，抗 生素的大量使 用，不论从环境或成本都是不值得的。在研 究重组大肠杆菌 HMS174(pTZ18U—PHB)质粒稳定性时发现 ，为了保证细胞正常生长及表达 ，在种子培养基中 必须添加氮苄青霉素 (Ap)，但 由于接种时种子带入的IOmgAp／L足以杀死丢失了质粒的细 收稿 日期：1999—10—19，惨回日期 }2000—02—17 维普资讯 2001年 28(2) 微 生 物 学 通 报 ‘87 ‘ 胞 ，因而在发酵阶段不必再添加 Ap! 另外，在连续培养中抗生素的添加采用周期性变化 (只 在无质粒细胞生长 占优势时添加)则经济得多 ，Lee等对此进行 了研究跚。而使用 由系统 内部 产生选择压力的培养是一种新的方法 ，通过偏利共栖和抑制来保护含质粒细胞已在实验室实 现 。 3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 不同培养操作方式对不同工程菌稳定性有不同的影响。为了保持细胞生长 良好的微环境 ， 延长受体细胞生长对数期，多采用流加操作方式；连续操作被认为是得到稳定性高的基因重组 菌株的重要手段；而间歇操作在基因工程菌培养中较少应用。培养工艺的建立必须先从理论上 了解其受体细胞生长动力学规律以指导环境参数、操作参数的顺序变化，多次重复和改进 ，由 此设计工艺操作 的各项指标 。 3．1 流加操作对工程菌稳定性的影响 流加培养适于生产重组基因产