SSR标记及其在植物病原真菌的研究中应用和前景.pdfVIP

SSR标记及其在植物病原真菌研究中的应用和前景1 1 2 蔺宇 ，朱振东 1 吉林大学农学部 2 中国农业科学院作物科学研究所 摘 要：SSR 标记是一种广泛应用的分子标记方法，但在植物病原真菌研究中处于起步阶段。 本文概述了SSR 标记的基本原理；从EST 中发掘SSR 的方法及其在植物病原真菌研究中的 现状和前景。 关键词：植物病原真菌；SSR 标记；EST-SSR 1.什么是SSR？ 简单序列重复（simple sequence sepeat，SSR ），也称微卫星 (microsatellite)，是指DNA 分子中 1－6 个碱基为重复单位的串联重复序列，其分布遍及人类，动植物和其它真核生物 染色体的编码区和非编码区[1,2] 。根据SSR核心序列排列方式的不同可将SSR分为精确型 (perfect)、不精确型(imperfect)、和复合型(compound) 。精确型SSR是指核心序列以不间断的 重复方式首尾相连构成的DNA ；不精确型的SSR是指在SSR的核心序列之间有3 个以下的非 重复碱基，但两端的连续重复核心序列重复数大于3 ；复合型SSR是指2 个或2 个以上的串 联核心序列由3 个或3 个以上的连续的非重复碱基分隔开，但这种连续性的核心序列重复数 [3] 不少于5 。由于SSR在不同的基因型间表现高度多态性，使其很快成为一种新的分子标记 。 SSR 标记为共显性标记，具有多态性高、不需要大量的DNA 、易于PCR 检测且操作简 便、重复性好、稳定可靠等特点，近年来受到人们广泛的重视，被应用于遗传育种，种属鉴 定，系统进化，遗传变异等研究领域。目前，SSR 标记已在动物和植物的研究中得到广泛的 应用，但在植物病原菌研究中，这一技术应用的较晚，现在仅仅处于起步阶段。 2.SSR 标记的开发 2.1 SSR 标记技术的基本原理 SSR 标记分析的基本原理是利用某一SSR 两翼区域特定的DNA 序列，来设计为位点专 一的引物，在PCR 仪上扩增单个SSR 位点，通过电泳，进行分析，在此基础上进行相应的 遗传分析。 2.2 SSR 标记技术开发策略 2.2.1 传统的SSR 标记开发策略 1本课题得到国家重点基础研究发展规划（批准号为2002CB 111406），国家自然科学基金（批准） 资助。 - 1 - 传统的SSR 分子标记开发技术路线如下： （a ）构建基因组文库 提取高质量基因组DNA ，通过限制性内切酶酶切或超声波处理获得基因组DNA 片段， 其中限制性酶切使用最多，应根据所希望的酶切片段长度、片段末端类型及内含 SSR 等要 求选择限制性内切酶，琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收纯化300bp-700bp 的片段，根据 DNA 片段特点（平端或粘端或特异内切酶位点等），直接（或连接特异接头序列后）与噬 菌体或选择相应的质粒载体连接，并转化到大肠杆菌进行培养。 （b ）阳性克隆筛选 人工合成放射性同位素或地高辛等其它化学物质标记的含有 SSR 序列的探针，与文库 中克隆进行菌落杂交，利用标记物质筛选阳性克隆。 （c ）测序及引物设计 提取纯化阳性克隆载体DNA （或直接利用载体引物）扩增出插入片段DNA ，经测序反 应后，用做序列分析。对于较长克隆可从片段两侧测序，得到含SSR 的序列。根据SSR 两 侧序列，利用引物设计软件，或人工设计引物。引物设计原则一般为引物长度为15bp －25bp 之间；GC 含量为50 ％，3 ’端为G 或C ；扩增产物长度为90bp-350bp 。 （d ）SSR 的PCR 扩增检测 设计的引物应在相应克隆及基因组中扩增得到一致的产物，才可作为有用的SSR 引物， 排除阳性克隆中SSR 两侧序列不保守的情况。 尽管传统的SSR 标记开发方法效率低，且花费大量人力物