活化Notch1信号对人舌鳞癌细胞生长影响及作用机制的的研究.pdfVIP

活化Notch1 信号对人舌鳞癌细胞生长的影响及作用 机制的研究1 1 2 2 1，* 段莉 ，姚军 ，伍欣星 ，樊明文 1武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室 2 武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室 摘 要：目的构建重组逆转录病毒表达载体pCLNRX-ICN ，研究过度活化Notch1 信号对人 舌鳞癌细胞系Tca8113 生长的影响，并对其作用机制进行探讨。方法 将人Notch1 基因胞内 区（intracellular domain of Notch,ICN ）克隆至逆转录病毒表达载体pCLNRX 中，采用 TM lipofectamine 2000 将pCLNRX-ICN与包装载体pCL-10A1 共转染293T细胞，制备重组病毒 上清，检测病毒滴度。通过逆转录病毒感染，将ICN基因导入并整合到人舌癌细胞Tca8113 细胞的基因组中,使Notch 1 信号在细胞中过度活化。MTT 法检测稳定表达Notch1(ICN)对 Tca8113 人舌癌细胞生长的影响， Western blot检测Notch1 和细胞周期蛋白激酶(cyclin WAF 1/CIP 1 dependent kinase ,CDK) 抑制因子p2 1 的变化。 结果 成功构建重组逆转录病毒载体 pCLNRX-ICN ，通过共转染可获得具有较高滴度的重组逆转录病毒。过度活化Notch1 信号 可以抑制人舌癌细胞Tca8113 的生长，并上调CDK抑制因子p21WAF 1/CIP 1蛋白的表达水平。结 WAF 1/CIP 1 论 过度活化Notch1 信号可部分通过上调CDK抑制因子p2 1 蛋白的表达水平而抑制人 舌癌细胞生长。 关键词：舌癌细胞；ICN；重组逆转录病毒载体；MTT；p21WAF 1/CIP 1 舌癌是最常见的口腔恶性肿瘤之一。外科手术和放化疗是目前治疗舌癌的主要方法。有 关舌癌发生的分子机理以及信号传导机制的研究较少。通过调控细胞信号影响肿瘤的生物学 行为，将为舌癌的治疗和预防提供新思路。Notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信 号通路之一，并对多细胞生物中细胞的增殖、分化起关键作用。有研究表明，外源性notch 分子胞内区组成性活化形式(ICN)的表达与notch配体激活notch分子后对靶细胞的作用相类 似，但外源ICN基因在靶细胞持续表达往往导致notch信号过度活化[1，2] 。因此，本研究通过 构建携带Notch1(ICN)目的基因的逆转录病毒载体，研究过度活化Notch1 信号对舌癌细胞生 长的调节作用，旨在探寻新一类抗肿瘤治疗靶点，为更深入的研究奠定基础。 材料和方法 1.1 材料： DMEM,特级胎牛血清,聚凝胺 （polybrene）（Sigma, USA）; 含Notch1 基因胞内区 （ICN） 的质粒pcDNA1/AMP-ICN由美国哈佛大学Paolo博士惠赠；逆转录病毒载体pCLNRX 、pCL-10A1 1基金项目：教育部博士点基金资助项目（20020486032） *通讯作者：樊明文， E-mail ：kqyywjtx@ ，电话：027 -1- TM WAF1/CIP1 (Imgenex, USA);lipofectamine 2000(Invitrogen);兔抗人Notch1，p21 抗体（Sa