鼠TNF-α功能位点及其中和性抗体结合位点研究研究报告.pdfVIP

Research Papers 研究报告 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2009, 36(4): 424~430 鼠TNF-α 功能位点及其中和性抗体结合位点研究* 1, 2) 1) 1)** 贾俊英 周洪哲 唐 捷 1) 2) ( 中国科学院生物物理研究所，北京100101； 中国科学院研究生院，北京100039) 摘要 肿瘤坏死因子TNF-α 是一个多功能的细胞因子，许多免疫系统疾病的发生和TNF-α 的过量释放有关．对TNF-α 的功 能研究有助于了解这些疾病的发生机制，而以TNF-α 为靶点的抗体可用于治疗多种自身免疫性疾病．通过研究一个抗鼠 TNF-α 中和性单克隆抗体的结合位点，确定了鼠TNF-α 行使其生物学功能的关键部位．首先利用酵母展示技术确定了中和 性抗体9C6 的结合位点是鼠TNF-α 的第29～40 氨基酸线性片段．然后在此区域引入点突变，找到鼠TNF-α 与9C6 抗体结 合的关键位点．最终用大肠杆菌表达鼠TNF-α 和其突变体蛋白，通过L929 细胞杀伤实验，证实与9C6 抗体结合的关键位点 也是决定鼠TNF-α 生物学功能的关键位点． 关键词 鼠TNF-α ，中和性抗体，结合位点，酵母展示 学科分类号 Q51 ，R392 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2008.00505 [1] 酿酒酵母为本实验室保存；L929 细胞购自英国菌 1975 年Carswell 等 首先发现，在接种BCG 的小鼠体内注射内毒素LPS 后，血清中产生一种 种保藏中心；pET-41d 质粒，由本实验室经 能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生血坏死 pET-41a 质粒切去GST 序列改造而来；pYDS 质粒 的因子，称为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, 改造自pYD1 (Invitrogen 公司) ；限制性内切酶， TNF).TNF 主要由单核细胞和巨噬细胞分泌产生[2] ， pMD19-T 载体购自TaKaRa 公司；T4 DNA 连接酶 与许多免疫系统疾病相关[3] ．TNF-α 通过55 ku 的 购自NEB 公司；鼠TNF-α cDNA 从Invitrogen 公 TNF 型受体或75 ku 的TNF 型受体作用引发细 司购买；单链DNA 引物及DNA 测序由北京三博 Ⅰ Ⅱ 胞毒性，参与免疫调控和细胞分裂等活动[4～7] ．已 志远生物技术有限公司完成；TransTaq High 知TNF-α 与一些免疫系统疾病如关节炎，强直性 Fidelity 高保真DNA 聚合酶购自北京全金式生物技 脊柱炎，败血症等密切相关．小鼠TNF-α 前体为 术有限公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA 235 氨基酸残基，其中包含由79 个氨基酸残基组 回收试剂盒购自Tiangen 公司；Ni 柱购自 GE 成的信号肽，成熟的小鼠TNF-α 分子质量为17 ku， Healthcare 公司；MTT 购自Sigma 公司；放线菌素 由156 个氨基酸残基组成．成熟的人TNF-α 与鼠 D 购自MERCK 公司；DMEM 培养基，Anti-V5-FITC TNF-α 的氨基酸组成有79% 同源性，三级结构极 抗体购自Invitrogen 公司，goat-anti-mouse-IgG-FITC 其相似，TNF-α 的生物学作用无明显的种属特异 购自SouthernBiotech 公司；goat-anti-mouse-IgG-HRP 性．人TNF-α 与其中和性抗体结合位点研究比较