实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.pptVIP

实 验 目 的 了解转化的概念及其在分子生物学研究中 的意义。 学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。 实 验 原 理 转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化的过程，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化的方法： (1)化学的方法(热击法)：使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； (2)电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 实 验 原 理 用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。 实 验 原 理 实 验 原 理 转化体的筛选方法： 主要用不同抗生素基因筛选。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。 实 验 原 理 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。 实 验 原 理 本实验使用的pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp)，理论上只有转入了质粒的大肠杆菌才能在含Amp的培养基生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此还需要通过提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。 实 验 原 理 重组质粒的筛选——α-互补法。 现在使用的许多载体（如pUC系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端１４６个氨基酸编码区。这个编码区中可以插入一个多克隆位点。 实 验 原 理 受体菌含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端氨基酸的序列。两者结合后有lacZ表达， 在含有生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成蓝色菌落。 实 验 原 理 当有外源基因插入到多克隆位点，从而造成插入失活，使lacZ基因不表达，最终形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。 实 验 原 理 实验仪器、材料、试剂 1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热 恒温培养箱，无菌工作台，微 量移液枪。 2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pUC19。 3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉 素Amp（50mg/ml）。 实 验 步 骤 1、每50ul感受态细胞加入2ul质粒DNA， 同时做一个空白对照。 转化体系 50ul 2ul 空白对照 50ul 2ul 感受态细胞 质粒DNA 蒸馏水 2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入1ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养 30~60min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于含有50ug/ml Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收； 6、平板倒置，37 ℃，过夜培养； 7、统计每个平板上单菌落的个数，计算转化率。 实 验 步 骤 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原 液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA） ＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组菌落数×稀释倍数× 菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细 胞总数 实 验 步 骤 注 意 事 项 1、转化好的细菌进行涂板时，可稀释不同 浓度，涂布在几块培养基上，以达到较