Midkine对人胃癌细胞生长影响及机制研究.pdf

·中文论著摘要· Midkine对胃癌细胞生长的影响及机制研究 目 的 胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，尤其在中国、韩国、日本等东亚国家。 尽管胃癌的诊断和治疗已经有了长足的进步，但进展期胃癌的预后依然很差，5 年生存率徘徊在20％～30％左右。在过去的几年中，已经证实胃癌的发生发展是 多基因改变的结果。胃癌中特殊基因的表达异常在不同的细胞功能中发挥重要作 用，如细胞粘附、信号传导、细胞分化、细胞增殖及转移。更好的了解胃癌发生 发展的分子机制将有利于胃癌的诊治及预防。 许多研究表明生长因子不仅促进组织细胞的增殖，而且能诱导组织细胞的恶 性转化，他们在人类肿瘤的发展中发挥了重要的角色。中期因子(Midkine，MDK， MK)是肝素结合生长因子家族的成员。人MK基因定位于1lpll．2，由5个外显子 和4个内含子组成。其启动子区域有视黄酸反应元件，因此视黄酸可诱导胚胎瘤细 胞系和某些组织MK的表达。成熟的MK是一种分泌性蛋白，它在妊娠中期胎儿组 织中分布广泛，出生后表达水平降低。在正常成人组织中，MK在小肠黏膜高表达， 在甲状腺中度表达，在肺、结肠、胃、肾及脾组织中微弱表达，而在肝脏完全不 表达。 近年来研究发现，MK高表达于多种人类恶性肿瘤，如乳腺癌、食管癌、胃 癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、神经母细胞瘤 和Wilm’s瘤等。这与其具有多种生物学功能有关，它不仅在神经发育过程中起 到营养及保护作用，还能通过促有丝分裂、促血管生成、诱导细胞恶性转化、抗 凋亡等功能影响肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡。 目前，关于MK与胃癌的关系研究较少。因此，本研究旨在探讨在人胃癌组 织中MK的表达情况，并研究其在胃癌发生、发展过程中的作用及分子机制。 方 法 一、Midkine在人胃癌组织中的表达 l、利用免疫组化方法检测MK在胃癌及癌旁组织中的表达。 2、利用实时定量PCR技术检测MK在胃癌及其配对癌旁组织中的表达。 二、Midkine影响胃癌细胞的增殖 胃癌细胞系中MK表达。 2、利用分子克隆方法构建MK逆转录病毒载体，并进行酶切及测序鉴定。 3、利用脂质体转染法将MK逆转录病毒载体及空载体转染人胃癌SGC7901 细胞，G418筛选获得稳定克隆后进行鉴定。 4、MK靶向siRNA瞬时干涉人胃癌BGC823细胞内源性MK表达。 5、利用MTT法及台盼兰拒染法检测MK高表达对SGC7901细胞增殖的影响。 6、利用MTT法检测靶向干涉MK后对BGC823细胞增殖的影响。 7、通过软琼脂克隆形成实验检测上调MK对SGC7901细胞克隆形成能力的 影响。 8、通过裸鼠成瘤实验检测上调MK对SGC7901细胞体内成瘤性的影响。 三、Midkine影响胃癌细胞增殖的机制 l、利用Western 影响。 2、利用Western Cdk2，Cdk4，Cdk6)的影响。 钴 里 =121 木 一、Midkine在人胃癌组织中的表达 1、免疫组化结果显示：MK在胃癌组织的阳性率为54％，而在癌旁正常组织 的阳性率仅为28％(P0．05)。 2、实时定量PCR结果显示：在19对人胃癌组织及其配对癌旁正常组织标本 中，有11例标本MK在胃癌组织的表达为癌旁正常组织的2倍以上(57．7％)，而 仅有2例标本MK在癌旁正常组织的表达为胃癌组织的2倍以上(10．5％)， (PO．05)。 二、Midkine影响胃癌细胞的增殖 1、实时定量PCR结果示：四种胃癌细胞系，按MKmRNA水平由高至低排序 为BGC823MGC802^厦KN1SGC7901。 2、经BamHI及EcoR I双酶切MK逆转录病毒载体得到大小分别为6Kb及 cDNA比对证实MK基因序列正确、完整。 量PCR及WesternBlot检测结果示，7号和11号克隆MKmRNA及蛋白表达水平 均较空载体对照组高5倍以上，且7号克隆高于11号克隆。 MK 4、实时定量PCR结果示：10nM