成素及其类似物检测方法的研究进展.docVIP

JulyChromatography霞，庞楠楠，廖一平，(jE索分子科学恩家实验室北京大学化学篙分子工程学院，=l匕泰100871≥。，藤n㈣勰虢％鼢舷∞*％獬j摘要：重组人促红细胞生成素(rhEPO)是一种激素类兴奋剂，近年来被滥用在一些耐力性比赛项目中。由于重组与内源性EPO的氨基酸序列相同，区别很小，并且在尿样或血样中的浓度低，代谢快，给检测带来了很大的难度。本文从直接方法和间接方法两个方面综述了近几年来兴奋剂rhEPO及其类似物检测的研究进展，并结合本小组关键词：重组人促红细胞生成素；兴奋剂；检测；直接方法；间接方法；综述文章编号：1000—8713(2008)04—0413．04erythropoietin(rhEPO)isdopings．Inyears．italwayscompetitionsports．Itextremelyendogenouserythropoietin(EPO)andogenoustheysequences．andrelativelyverypaper，theprogressanalysisanalogsbyprospectsdopinggroup．Keyerythropoietin(rhEPO)；doping；detection；directmethods；methods；review一，随着2008年北京奥运会的日益临近，反兴奋剂健康，干扰运动员的科学训练和刻苦训练，而且违背公平竞争原则和国际公认的体育道德，是一种欺骗行为，严重影响体育事业的健康、可持续发展。对于现代奥运会来说，激素类的检测，如兴奋剂重组人生长因子(rhGH)、重组人促红细胞生成素(rhEPO)、绒毛膜促性腺激素(HCG)等是分析化学的难点。其原因在于，在检测过程中难以将基因重组的激素与内源性激素区分开来，而且这些激素在血液和尿进展，并结合本小组的工作展望了兴奋剂检测的发促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白，绝大部分由肾脏产生，其最主要的功能是促进红细胞的生成，提高机体血红蛋白的浓度，临床上主要用于治疗天然EPO活性几乎相同的重组人EPO产品，它能够改善机体携氧能力，明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白含量，从而提高人体运输氧的能力，提高人体最大摄氧量，增强人体耐力，对肌体的有氧工作霞，博士研究生．E—mail：xyang@pku．edu．an．通讯联系人：刘虎威，教授，博士生导师．Tel：(010E—mail：hwHu@pku．edu．cn基金项目：国家自然科学基金资助项目(No． 能力有明显的促进作用，可减少肌体的运动性疲劳，故而有人在比赛或赛马中滥用，以提高运动成绩。因此，从1990年起，国际奥委会(InternationalOlympicCommittee，IOC)正式将EPO列为禁用药物‘2|。蛋白，其分子骨架为165个氨基酸组成的肽链，具有000，其中糖链的末端，它是rhEPO的活性成分，唾液酸含量2001年，市场上又出现了一种新近开发的红细胞生成刺激蛋白(erythropoiesisstimulatingprotein，NESP)，也称Darbepoietin一“(DPO)¨。，它是在促rhEPO不同的是，DPO有5个糖基化位点，而不是3个；DPO的糖基化位点增加，相应的其唾液酸含量也随之明显增加，与内源性和基因重组的EPO相比，DPO的唾液酸含量更高，这就赋予了它更长的半衰期和生物活性。此外，随着商品的更新换代，EPO的小分子仿照品，如EPO—zeta∽1和基因型兴奋剂，也会渐渐面世，这将给反兴奋剂工作者带来巨2000年，法国科学家Lasne和de次报道了人尿中内源EPO(uEPO)和rhEPO的检测方法。之后，Lasne等¨1完整详细地描述了该方别，利用等电聚焦法(IEF)、二次印迹、化学免疫发骤：首先，将20mL的尿样过滤(采用截留相对分子其他杂蛋白)，并浓缩至2mL(使尿样中的EPO的IU／L)；将浓缩后的尿液进行等电聚焦(由于rhEPO和uEPO之间存在等电点的差别，故可以通过IEF将其区分开来)；之后，将凝胶上的条带转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上进行二次印迹(Double-blotting)(二次印迹可以有效地阻止第二抗体的非特异性结合，从而避免假阳性结果的出现)；最后，在发光氨和过氧化氢的作用下进行化学然而，该方法过程复杂，步骤繁多，容易出现误差，存在着很大的缺陷。近几年来，许多反兴奋剂工毛细管电泳(CE)方法是最初研究最多的。de带电泳法在缓冲溶液中加入腐胺(1，4一二氨基丁烷)、尿素、两性离子来抑制EPO在管壁上的吸附，然可实现EPO几种糖化体的基线分离，但平衡时间长，检测时间长(约90min)，重现性差，缓冲溶液不稳定，并且因为所用缓冲溶液体系