核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类.pptVIP

分子杂交技术的目的是什么？ 分子杂交的基本方法有哪些？ Southern印迹法有哪些步骤，为了达到什么目的呢 为什么叫印迹法呢？ 1975，Southern 印迹杂交法: DNA 1977，Northern印迹杂交法：RNA 1979，Western印迹杂交法：Protein 由Southern 1975年设计。 被检测对象为DNA。 具体研究什么呢？ 克隆基因DNA的酶切图谱分析 【哪里可以剪开】 基因组中某一基因的定性与定量分析 【有没有这个基因；在哪里】 基因点突变【在哪个地方出现突变】 限制性片段长度【可以被剪开的片段多长】 （一）待测核酸样品的制备 提取待测DNA 用限制酶将DNA切成大小不同的片段 用EDTA，65℃灭活限制酶，进入下一步骤——电泳分离片段。 （二）电泳分离DNA片段 目的：确定杂交靶分子的大小【待测片段】 原则：分辨大片段用低浓度胶； 分辨小片段用高浓度胶 如何确定片段大小：用marker 【标准分子量DNA】 胶的注意事项有四条，一起来看书： （三）印迹转移前凝胶的预处理 分子量不同所需转移的时间不同； 浸泡在0.25M的HCL溶液中脱嘌呤 再进行碱变性，待测DNA链断裂单链，以便与已知序列的DNA杂交 （四）转膜（印迹） 谁转移？ 将凝胶中已成单链的待测DNA片段 转移到哪里？ 膜：固相支持物，常用NC膜和Nylon膜 转移后有什么特点？ 转到膜上的相对位置跟在凝胶中的一样 （五）、核酸探针 1、探针（probe）的概念  指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体等均可看成是探针与靶分子的相互作用。 基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。 4、探针基本条件（特点） 标记物（32p, 35S, 125I, 地高辛（DIG）, FITC） 单链核酸（ssDNA） 高特异性（~500bp） 标记物稳定灵敏，检测方便安全 探针标记物 放射性标记物： 32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d) 非放射性标记物： 半抗原：生物素、地高辛 荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC） （六）核酸的固定 1、烘烤 80℃2小时 2、紫外光固定 3、碱固定 （七）杂交 1、预杂交 （1）目的：减少非特异性杂交 【探针会与其他非互补核酸产生非特异性结合，所以杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭】 （2）成分： 去污剂：1%SDS （可促进溶液对薄膜的覆盖，可 抑制RNase酶活性） 封闭剂： 鲑鱼精子DNA（与探针无同源性） 高分子化合物： Denhard氏溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 2、杂交 影响杂交的因素 ◇核酸分子浓度与杂交速率 ◇高浓度双链探针的杂交 ◇碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快 ◇盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与 杂交稳定性也成正比。 ◇温度：与杂交速率成正比。 ◇甲醛：可降低Tm值。 ◇错配的核酸序列：错配降低杂交速率。 ◇杂交的加速剂 （八）洗膜 除去溶液 未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探针 （九）杂交信号的检测 放射自显影 非放射性杂化分子的检测 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA指纹分析 四、斑点杂交和狭缝杂交 补充：生物芯片技术 1.1 生物芯片的分类 (1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray) (2) 蛋白质芯片(Protein chip) (3) 芯片实验室(Lab-on-a-chip) 基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列信息。 它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。 目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。 蛋白芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。 芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应和检测分析的全过程集约化，形成微型分析系统。目前，这种形式尚处于研发阶段。 1.2 DNA芯片技术的基本原理 D