核酸分子杂交课件.pptVIP

核酸分子杂交方法及特点 3．DIG 标记探针的方法 基本方法 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。 四、冲洗  杂交后冲洗是减低非特异性杂交的关键步骤，其SSC的浓度可低至0.1×SSC。  应用放射性核素探针时，冲洗可达几小时，而用生物素及地高辛等标记的探针冲洗时间则可缩短为15分钟。  冲洗时温度不能高于50℃，否则将导致组织细胞结构的破坏及组织或细胞从切片上脱落，使实验失败。  五、显示  核酸原位杂交结果的显示应体现特异性和敏感性。当DNA探针长度超过0.5Kb时非特异性杂交增多，本底增高。 探针与无关基因中部分同源顺序的非特异性结合亦是非特异性杂交的原因之一。 除探针的非特异性结合外，检测系统亦是导致非特异性结果的原因之一。 生物素标记的探针，常用免疫组织化学技术检测，在许多组织中因含有内源性生物素（维生素H）而出现假阳性结果。地高辛标记就不存在这种问题。 **对照试验 （一）DNA印迹技术 Southern blotting 又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等，亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 Paper Towels Southern Blotting tissue SDS 蛋白酶K 酚/氯仿 无水乙醇 离心 （二）RNA印渍技术 Northern blotting 又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 （三）蛋白质印渍技术Western blotting 又称为Western杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 应用：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 三种印迹技术的比较 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 斑点印迹Dot blotting 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。 原位杂交in situ hybridization 即组织原位杂交，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。 原位杂交 Northern blot BMP-4转染与未转染细胞mRNA斑点杂交 双标记阳性者同一细胞中 原位杂交信号呈紫蓝色，位于细胞核中； 免疫组化阳性呈棕色，位于细胞膜或浆上 /med/data/jcyx/blswx/201003/344927.html淋巴瘤的原位杂交和免疫组化双标记技术 * 核酸分子杂交 (Hybridization of nucleic acids ) DNA的均一性：病毒DNA—均一DNA, Tm值范围窄。 动物细胞DNA—不均一DNA, Tm值范围较宽。 核酸分子杂交的双方是待测核酸序列及探针。 待测的核酸可以是克隆基因片段、基因组DNA、细胞总RNA。 将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交（膜上印迹杂交），也可以直接在细胞内进行（原位杂交）。  探针（probe）：是一种已知的、仅与特异性靶分子反应的分子。 探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。 常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。