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 一种基因编码的细胞内铜离子荧光探针# 房晓明，杨弋** （华东理工大学药学院，生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237） 5 10 摘要：作为生物体内最重要的金属元素之一，铜通过辅因子的形式广泛参与生命过程，与蛋 白质、核酸等大分子相互作用，在生命医学科学中扮演了重要角色。生物体对于细胞内的铜 离子含量有严格的调控机制，铜的过剩或缺乏都会导致疾病。因此，针对铜离子进行定性或 定量的特异性检测对生命医学科学具有重要意义，能够实时动态观察活细胞内铜离子状态的 方法逐渐成为研究的热点。本文利用原核细胞中的转录调控蛋白 Fur 对金属选择性结合的特 点，融合荧光蛋白突变体，利用基因工程的方法构建了一系列铜离子荧光蛋白探针样品，通 过活菌检测筛选获得了对铜离子响应高选择性好的荧光探针 FS-4，可直接用于细胞内的铜 离子实时动态检测。 关键词：荧光蛋白；铜离子；探针；Fur 中图分类号：Q51 15 A Genetically Encoded Fluorescent Biosensor for Copper in Living Cells Fang Xiaoming, Yang Yi (State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, School of Pharmacy, East China University of 20 25 30 35 40 Science and Technology, ShangHai 200237) Abstract: Copper is one of the most important element for life, which is required mainly in the form of cofactor for biological processes. Organisms developed sophisticated mechanism for metabolism of this metal, which has been kept in a narrow range in cell, because misregulation of copper is known to result in neurodegeneration diseases. Therefore, a real-time detection method for visualize copper inside is significant for farther research. We developed a genetically encoded fluorescent copper sensor basing on cpYFP and a responsor of gene transcription Fur. With protein engineering and molecular biology technology, we construct a series of fusion protein varieties as sensor candidates. The final biosensor FS-4, which is achieved by whole-cell screening, performed dramatically fluorescent changes towards copper binding. With high sensitivity and selectivity, FS-4 will be used for copper detection in living cells. Keywords: fluorescent protein; copper ion; sensor; Fur 0 引言 铜是生物体的一种重要痕量金属元素。一方面，它以辅因子的形式参与多项生命过程[1]； 另一方面，铜离子参与催化活性氧自由基，会导致对脂类、蛋白质、DNA 等其它生物分子 的氧化损伤[2]。为了保护细胞免受铜离子毒性的作用，机体有一套精密而完整的调控机制调 节该元素在体内的提呈、转运和存储。人体中铜离子代谢异常会引发门克斯综合征[3]，威尔 森氏病，以及某些神经退行性疾病[4]。生物体内铜离子代谢研究的发展对其检测手段提出了 更高的要求。除了传统的金属检测方法，如原子吸收光谱法[5]和紫外分光光度法，化学小分 子探针也有长足发展，已有可以用于细胞内铜离子成像的实例[6][7]。然而化学小分子探针存 在水溶性，毒性，细胞渗透和细胞器定位等众多需要解决的问题。 另一方面，基因编码探针是在细胞内直接生成，