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Western Blot 详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western 免疫印迹（Western Blot ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检 测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物， 可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot 技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB 呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.Marker 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问 8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、 原理 与Southern 或Northern 杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶 电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分 离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共 价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固 相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素 标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目 的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL 和底物DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第 一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就 行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+ 鲁米诺，如遇到HRP ，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂 1、丙烯酰胺和N ，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热( 以利于溶解双丙稀酰胺)的去 离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙 稀酰胺29g，N ，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O 至100ml。)储于棕色瓶，4 ℃ 避光保存。严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催 化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2 、十二烷基硫酸钠SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，室温 保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和48ml1mol/LHCL 混合， 加水稀释到100ml 终体积。过滤后40C 保存。 4 、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于40mlH2O 中，用约 48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8 加水稀释到100ml 终体积。过滤后40C 保存。这两 种缓冲液必须使用Tris 碱制备，再用HCL 调节PH 值，而不用Tris.CL。 5、TEMED 原溶液N ，N ，N’N’ 四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速 两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。 提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6、SDS加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml 混匀备用。按1:1 或1:2 比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min 混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋 白量100μg。 7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至 1000ml，得0.25mol/L Tris- 1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10 倍。 8、转移缓冲液：配制1L 转移缓冲液，需称取2.9g 甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS ， 并加入200ml 甲醇，加水至总量1L。 9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10 倍即成丽春红S 使用液。使用后应予以废弃。 10、脱脂奶粉5%(w/v)。 11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。 12、Tris 缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mm