选修三基因工程晚读.pptVIP

专题一 基因工程 切割DNA的限制性核酸内切酶 连接DNA片段的DNA连接酶 将目的基因送入受体细胞的运载体 基因工程第一步——目的基因的获取 方法：分为直接分离法和人工合成法两类 利用PCR技术扩增目的基因 1、概念：快速在体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 2、原理：DNA双链复制 3、条件：已获取的目的基因为模板，游离的四种脱氧核苷酸为原料，热稳定DNA聚合酶以及一对引物(既不相同 也不互补，约30个脱氧核苷酸组成，能分别与目的基因的两条链部分配对，作用是使热稳定DNA聚合酶从引物的3′端将游离的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接到已有的片段上） 4、过程：第一步变性，90～95℃，DNA模板解链；第二步复性(退火)， 55～60℃，两种引物与两条模板通过碱基互补配对结合；第三步延伸，70～75℃，在热稳定DNA聚合酶的滑动下, 以5′到3′的方向合成两条子链 5、结果：在PCR扩增仪中以指数方式扩增，即1个变为2n个(n为循环次数) 基因工程第二步——基因表达载体的构建 基因工程第三步—将目的基因导入受体细胞 基因工程第四步—目的基因的检测与鉴定 基因工程的应用 1.乳腺生物反应器的制造过程：将药用蛋白基因(目的基因)与乳腺蛋白基因的启动子等组件构建出药用蛋白基因在乳腺细胞内能表达的载体，经显微注射技术导入到受精卵中，再移植到子宫，妊娠分娩出转基因动物，挑出雌性进行培育，到达泌乳期后，分泌的乳汁中即含有药用蛋白. 2.基因治疗是指将健康的外源基因导入患者有基因缺陷的细胞内，表达相应蛋白质发挥功能，分为体内基因治疗和体外基因治疗，目前都处于临床试验阶段。 蛋白质工程 1.概念：以蛋白质分子结构与功能关系为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造或创造一种新的蛋白质以满足人类的需求。 2.优点：基因工程只能生产自然界已有的天然蛋白，而蛋白质工程可生产出人造蛋白。 3.过程：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，最终找到相对应的脱氧核苷酸序列，得到的人造基因只有外显子。 4.实质：对基因结构进行修饰或改造 * * 1.概念：将人们感兴趣的基因（外源基因，目的基因）装在运载体上导入受体细胞，稳定高效的表达，最终获得人类想要的蛋白质或新的性状！ 5.优势：基因工程育种相对传统四种育种方法，优势在于能定向改造生物的性状；实现不同物种的基因交流。 3.工具：工具酶(限制性核酸内切酶和DNA连接酶)，运载体(常用人工改造的质粒) 4.过程：第一步目的基因的获取；第二步基因表达载体的构建；第三步将目的基因导入受体细胞；第四步目的基因的检测与鉴定。 2.原理：基因重组 1、来源： 2、化学本质： 主要是原核生物 3、作用特点： 蛋白质 ①识别特定的脱氧核苷酸序列体现专一性 ②在特定部位的两个脱氧核苷酸之间切开 4、作用部位： 磷酸二酯键 5、作用结果： 黏性末端和平末端 6、切割对象： 目的基因和运载体 限制酶不能断裂脱氧核苷酸内部的化学键，不同限制酶切割不同DNA产生的黏性末端可能相同 1、作用实质： 2、前提条件： 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 3、连接对象： 被缝合的片段黏性末端互补（相同） 被相同的限制酶切割的目的基因和运载体 副产物：目的基因-目的基因；运载体-运载体 4、种类： E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；而T4DNA连接酶黏性末端和平末端(效率较低)都能连接 DNA聚合酶,RNA聚合酶,DNA连接酶,限制酶作用的都是磷酸二酯键，而DNA解旋酶作用的是DNA两条链之间的氢键！ 1、种类： 2、作为运载体应具备的四个条件： 有三种，分别是质粒；λ噬菌体衍生物；动植物病毒 ⑴有一至多个不同的限制酶切割位点，便于目的基因的插入，最好每种酶切割位点只有一个 ⑵能在宿主细胞内大量复制从而稳定地保存 ⑶具有某些标记基因，便于对重组DNA进行筛选 ⑷对受体细胞无害 由于以上条件天然质粒不能完全符合，所以基因工程用的质粒都是人工改造的。 1.直接分离法：具体做法是先提取出某种生物的所有DNA，用适当的限制酶将其切割成许多个一定大小的DNA片段，然后与运载体拼接后导入受体菌储存，最终就建立该生物的基因组文库。 2.人工合成法又分为反转录法和化学合成法，反转录法具体做法是先提取出某种生物的成熟mRNA，在反转录酶的作用下得到双链的互补DNA(cDNA),cDNA只有外显子，无内含子启动子终止子,同样与运载体拼接后导入受体菌储存，最终就建立该生物的cDNA文库；化学合成法具体做法是根据已知的氨基酸序列先推测出mRNA的核糖核苷酸序列，再推测出外显子的脱氧核苷酸序列，接着用DNA合成仪按相应顺序合成目的基因。 这步是基因工程的核心 1.目的：使目的基因在受体细胞中