反义技术在细菌中的研究进展.pptVIP

反义技术 意 义 随着基因工程技术的蓬勃发展和代谢调控研究的深入，反义技术作为一种温和调控的基因工程技术，开始向世人展示其无穷的魅力． 与基因敲除等功能缺失性研究方法相比，反义技术具有投入少、周期短、操作简单等优点，受到广泛的关注，成为细菌代谢调控的有力工具． 以下对反义RNA、反义寡核苷酸，核酶这几种反义技术在细菌代谢工程操作中的研究进展及存在的问题进行了概述． 反义技术介绍： 反义技术：是通过碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细胞的生长、分化等。 根据核酸杂交原理来设计， 针对特定靶序列 人工合成DNA或RNA小分子，由7到30个核苷酸组成 功能： 有选择地结合目标，影响转录或翻译，促进结合产物的降解 分类： 反义DNA，反义RNA（核酶） 何谓“反义” 靶是有“正义”的链 反义核酸与靶结合，为了区分，把补充进的链定义为“反义” 反义技术的两种技术路线 将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达。 体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用。 应用于细菌的反义技术 反义技术包括：反义RNA、反义寡核苷酸、核酶、RNAi。 目前适用于细菌的反义技术主要有反义RNA、反义寡核苷酸、核酶。反义技术的作用原理是与目的基因、mRNA结合，从而达到抑制因表达的目的。 反义RNA(Antisense RNA) 反义RNA是一段本身不被翻译的RNA序列。反义RNA对基因表达的调控是细菌天然的代谢调控方式之一。 细菌体内本身存在反义RNA调控机制，因此在细菌中利用反义RNA用于基因表达调控有很多优点： (1)与基因敲除相比，对细胞的正常生长影响较小； (2)可在菌体达到一定生物量时诱导表达，达到既抑制基因的表达，又不影响细菌的正常生长的目的，因而可以定时、有效地调控蛋白表达； (3)可持续稳定地表达反义RNA分子； (4)可选择性地抑制基因表达。 反义寡核苷酸 (Antisense oligonucleotides，AS-ODN) 反义寡核苷酸技术就是将一段可以与目的基因序列特异性结合的单链寡核苷酸导入细胞，该序列与目的基因成碱基互补配对成为DNA—RNA双链，通过阻碍目的基因的表达，加速 mRNA的降解，达到调控代谢的目的。 反义寡核苷酸在细菌遗传操作中已经得到了一定的应用，但细菌的繁殖速度快，反义寡核苷酸在细菌分裂过程中不能稳定地传递，而修饰的成本过高，应用范围较窄，因此目前反义寡核苷酸技术仍主要用于基础理论的研究。 核酶(Ribozyme) 核酶(Ribozyme)是具有催化活性的特殊的反义RNA，它有高度专一内切核酸酶的活性，可与靶序列杂交并加以剪切，从而对基因表达进行调控。锤头型核酶是研究比较深入的一类。 在实际应用中，核酶同样面临着稳定性和有效位点的选择等问题。 细菌中不存在RANi现象，缺少相应的酶，所以RNAi技术不能用于细菌的遗传操作！ 因此—— 在以上可用于细菌的反义技术中，反义RNA技术具有作用效果明显，可稳定的诱导表达，可随细胞的繁殖而分配到子细胞，作用效率可调节等其他反义技术不能比拟的优点，更适合调控代谢细菌。因此反义RNA技术在细菌的代谢工程中应用最广。 反义分子的设计 设计选择适当的目的mRNA分子靶位点来抑制mRNA的翻译成为反义技术的核心问题。 1 . RnaseH分析 2 . 酶切图谱分析法设计反义分子 3 . 软件模拟分析 4 . DNA芯片技术应用于设计反义分子 反义技术作用效果的评估 1 、mRNA水平的检验 Northern印迹和荧光夹心原位杂交 2、蛋白水平的检测 免疫杂交技术，Western blotting印记检测蛋白合成量的变化 3、代谢流量变化的分析 将代谢流作为一个评估反义分子作用效果的指标 4、细菌合成的底物和产物检测 对底物化率和产物产率的检测是必要也是最终的检测指标 反义技术的应用——  “机遇与挑战并存” 第一，从反义分子的应用效果来说，反义分子的传递效果、调控效率等问题仍然需要深入的研究和探讨； 第二，反义分子抑制基因表达程度的问题，即抑制多少基因表达量才能达到预期目标； 第三，从反义技术基础理论来说，反义分子如果和细胞内其他基因或mRNA相互作用会导致难以预料的结果。 展望 随着越来越多的有价值的细菌基因组测序的完成，人们研究的重点已转向对基因功能的研究；而且近年来代谢工程