酶与细胞固定化.pptVIP

酶与细胞固定化 第一节 概述 第二节 酶和菌体固定化 第三节 微生物、植物和动物细胞固定化 第四节 原生质体固定化 第一节 概述 一、酶与细胞固定化的概念 二、天然酶在应用中的一些缺陷 三、固定化酶特点 一、酶与细胞固定化的概念 三、固定化酶特点： 第二节 酶和菌体固定化 一、基本概念 二、酶和菌体固定化方法 酶和菌体固定化方法很多，主要有吸附法、 包埋法、结合法、交联法等。 1.吸附法 2.包埋法 3.结合法 4.交联法 5.热处理法 三、固定化酶的性质 四、固定化酶的应用 1、吸附法 (1) 原理： c. 混和振摇装载法 (mixing or shaking bath loading) ： 是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。 该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。 d. 反应器装载法(reactor loading process)： 这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。 界面聚合法： 利用在微滴的界面通过加成或缩合反应形成水不溶性多聚体制成微囊包埋酶。 例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween—20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。 表面活性剂乳化液膜法： 在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。 3、结合法： b.共价键结合法(共价偶联法Covalent coupling or covalent binding)： 通过共价键，将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联以制备固定化酶的方法。 ① 重氮法： 这是带芳香氨基载体的主要反应，即载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。（见示意图） ③ 溴化氰法： 带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常用的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活泼的亚氨碳酸基，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价偶联反应（见示意图） ⑤ 异硫氰酸法： 含芳香氨基的载体也可先用硫光气处理成异硫氰酸(或异氰酸)盐的衍生物，这样得到的产物极易在温和条件下和酶分子的氨基反应。由于在中性pH条件下优先和α-氨基反应，因此可进行选择性偶联。 （见示意图） ① 选择适宜的固定化方法与相应的载体。 例如：采用重氮法时要注意载体的亲水性与疏水性； ② 严格控制反应条件，提高反应的专一性。 例如：使反应局限于α-氨基，保护ε-氨基； ③ 应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与必需基团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。 例如：在进行腺三磷酶(ATPase)固定化时，可先用对羟汞苯甲酸(PHMB)将酶的活性巯基保护起来，然后通过叠氮反应将酶偶联于羧甲基纤维素上，在完成固定化以后，再用还原剂使-SH活化，这样可得到高活性的固定化酶。 4. 交联法(crosslinking) (1) 基本概念： 利用双功能试剂或多功能试剂(bifudoctionalor multi-functional)在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。 (3) 制备方式： 利用戊二醛两个醛基都可与酶蛋白分子的游离氨基反应，形成Schiff碱，从而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。 在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然