蛋白偶联操作步骤20120503.docVIP

Bio-Plex 氨基耦联原理与操作 一、原理 Bio-Plex 氨基耦联试剂盒提供了一些缓冲液，用于将6－150kD分子量的蛋白质共价耦联到5.5um荧光染色的微珠上。耦联反应发生在微珠表面的羧基和蛋白质N末端的氨基上，进行羧胺反应。耦联后形成稳定的共价键，不会轻易脱落，甚至可保存数月。试剂盒可进行30次反应，每次反应需要1.25×106个羧基化的微珠（1倍浓度）。这种蛋白质耦联微珠可用于蛋白质相互作用的研究。一般微珠反应得率为80％，即足够用在Bio-Plex上进行检测的每孔5000个微珠。 一般耦联需要3步：蛋白质准备，蛋白耦联和蛋白耦联验证。 A、蛋白质准备： 蛋白质样品的要求： 1、蛋白质分子量：6－150kD， 2、水溶性， 3、样品不得含有如叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其它任何含自由氨基的添加物。 4、蛋白质必须溶解在PBS中，pH7.4。 5、必须摸索出最佳的耦联条件，主要是摸索蛋白质的使用量。 注意，不需要用最大量的蛋白质进行反应。 B、蛋白耦联：耦联反应分2步进行，微珠上的羧基在耦联前需要活化，EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]炭化亚胺）与微珠上的羧基反应形成一种活化的O-酰基异脲（O-acylisourea）中间体，在水溶液中用S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) (巯基乙酰基三甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-MAG3）使这种中间体变得稳定。EDC耦联S-NHS产生了S-NHS-活化位点，O-酰基异脲和S-NHS的形成是氨基反应。但是S-NHS酯在生理pH下更稳定，随后这种中间体与蛋白质上的初级氨基反应形成酰胺键。如果这种中间体不能和氨基反应，中间体将脱水并产生羧基，释放出N-未取代脲。这些反应在数分钟内同时迅速反应。 C、蛋白质耦联验证：耦联反应结束后需要对微珠进行计数并验证耦联效率。 用PE（藻红素）标记的抗体连接到耦联的微珠上，再用Bio-Plex进行分析。 或者用生物素化的抗体反应再用Streptavidin-PE(链亲和霉素－藻红素)，机器读出的荧光信号直接与耦联在微珠表面上的蛋白量相关，如果荧光信号超过2000MFI可认为耦联成功。 二、耦联操作 A、蛋白质准备：如果样品不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其它含自由氨基的添加物，并且已溶在PBS，pH7.4中，可测定蛋白质浓度后直接用于耦联；如果样品含有以上任何一种添加物，需要进行如下处理：使用Micro Bio-Spin 6微型柱进行更换缓冲液，1000g，2min离心去除缓冲液，加入500ul PBS，1000g，2min离心，重复5次，20－75ul的样品上样到柱子中，1000g，5min离心，样品冰浴，测定蛋白质浓度后可直接用于耦联。 注意：更换缓冲液可能导致多达20％的蛋白质损失， 必须准备足够耦联反应所需的5－12ug的蛋白质 B、耦联反应：在所有试剂使用前必须解冻或回复到室温 1）微珠活化： 2）蛋白耦联 三、耦联效率验证：可使用2种反应进行验证，一种是用PE耦联的抗体，另一种是先用生物素化的抗体然后用Streptavidin－PE 注意：所用的抗体种属必须一致，例如已经耦联了一个鼠抗人的抗体，那么二抗必须是来源于鼠的抗体，如羊抗鼠和兔抗鼠等。 四、结果分析： 阴性对照（背景）的荧光值不得超过100MFI，耦联微珠的荧光值超过2000MFI可认为耦联成功，如果耦联不成功，必须分析各种原因，如操作，耦联蛋白质浓度和蛋白量等等。 五、除耦联试剂盒外所需的仪器和试剂及准备情况 1、Bio-Plex蛋白质芯片系统 2、Bio-Plex蛋白质芯片系统附件：Validation kit和Calibration kit 3、漩涡混合器 4、离心机 5、超声波清洗器（可选用） 6、细胞计数器(没有) 7、蛋白质测定（如lowry法，以BSA作为标准） 8、缓冲液更换层析柱（根据蛋白质的状况选用） 9、化学试剂：EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]炭化亚胺），S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) (巯基乙酰基三甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-MAG3） （已购买） 10、其它试剂和耗材：对耦联蛋白特异的抗体（需R-藻红素，phycoerythrin或生物素标记，没有）， Streptavidin-PE(链亲和霉素－藻红素，没有)， tips头（10 ul，200 ul，1000 ul）移液枪（10 ul，200 ul，1000 ul），铝箔，小离心管，96孔平底虑板，小角底槽等 注意：EDC必须确保新鲜，反复冻融不得超过5次，最好分装后一次性使用。 摸索最佳蛋白量，可做2倍比稀释的梯度