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硕士学位论文 猪乙型脑炎抗原表位的原核表达及以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗的免疫原性研究 中文摘要 乙型脑炎E蛋白是该病毒的主要的抗原蛋白，本实验将乙脑E蛋白主要抗原 片段基因串联，包括E蛋白上两个重要抗原域73aa一88aa，292aa一402aa，并将 其定向连接至原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达质粒pET-EAB。将重组质 粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)，试验确定表达出的目的蛋白主要以包涵体的形式 存在。使用 WesternBlot方法对纯化复性后的包涵体进行检测，证实其具有免疫 活性、，从克隆质粒pET-EAB中酶切出EAB基因，并与酶切回收的真核表达载体 pCI一neo定向连接，构建出真核表达质粒pCI一EAB。将重组质粒pcl一EAB转染ver。 细胞，其表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验的方法检测出目的基因的转 录与表达。以lxl护、lx108、lxl护cFu剂量口服接种BALB/c，J、鼠，分析其 体内安全性和稳定性。结果表明，利用该减毒沙门氏菌作为载体具有相对安全性， 用限制性酶切分析鉴定证实，重组质粒在S.C50O菌株在体内比较稳定。体外培养 S.C50O/PCI一EAB重组菌，分析其在体外的稳定性，结果表明oD600nm在0.8左右质 粒是比较稳定的。以lx10scFu剂量的重组菌口服免疫小鼠，同时设含空载体沙 门氏菌口服组，质粒pCI一EAB肌肉注射组和PBS口服做参比对照。检测免疫小鼠 血清抗体水平，脾脏淋巴细胞增殖功能，外周血T淋巴细胞亚群的差异。结果显 示在二免后一周和三免后一周，重组菌抗体水平与 s.c500/pCI一ne。空载体组差异 显著(p0.01);脾脏淋巴细胞增殖情况显示，重组菌对ConA有显著的反应性， 且与对照组差异明显，同时CD3+、CD4+、CDS+T细胞的数量也显著高于对照组 (p001)。上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗具有良好的安 全性、稳定性和免疫原性，为防治猪乙型脑炎提供了口服活菌疫苗的研制奠定了 基础。 关键词:乙型脑炎病毒;E蛋白主要抗原域;原核表达;减毒猪霍乱沙门氏菌C500: 免疫原性 夕四川农业大学2010届硕士毕业论文 ProkaryoticExPressionofmajorantigenicsegmentof JaPaneseencePhalitisvirusandtheInllnune EfficiencyStu即 ofItsDNAVaceinedeliveredby SalmonellaeholeraesuisC500 Abstraet JaPaneseencePhalitisvirusEProtein15themajorantigenProtein，the exPerimentwillbethemajorantigenicseglnentofJEVEProteingeneinseries， ineludingtheEProteinonthetwomajorantigenicdomainof73aa一88aa，292aa 科02aa。 ThenthefragmentwaselonedintotheProkaryoticexPressionveetor PET一 32a(+)andnamedPET一E邓 .AfterconfirmedPositivebyenz卿 edigestion，the recombinantPlasmidwastransformedint0E· coliRosetta(DE3)， indueedusing IPTGfortheexPressionofEABProtein.TheexPressedProteinwasdetectedinthe formofinclusionbodyandseeretoryProtein.DetectedbyWesternBlot，theE^B ProteinPossessessPeeifiereactionogenieity.ThePET-EABPlasmidwasdigestedwith EeoR1andNOt1toobtainEABgenefragment， thenthefraglnentwassubclonedinto thetheeukaryoticexPressionvectorPCI一 neoandnamedPCI一E朋 Therecombinant PlasmidPCI一 E^BWast