建 议项目.docVIP

项目一：青霉素酰化酶高活性发酵、固定化及其应用 一、项目简介 目的意义： 粪产碱杆菌青霉素酰化酶（A.faecalis PGA,AfPGA）目前研究的相对较少，其基因到1994年才被克隆（美国专利5695978）。与其他来源的PGA比较，AfPGA的酶学性质有独特的优点：（1）AfPGA对底物具有更高亲和力，其Kcat值是所有PGA中最高的；（2）AfPGA是PGA家族中唯一具有链内二硫键的成员，酶的热稳定性和PH稳定性均很高；（3）在手性分子识别上，AfPGA比EcPGA具有更高的选择性;（4）AfPGA在有机溶剂中表现出很高的稳定性。由于AfPGA是目前知道的在对映体选择性、稳定性等方面最具优势的青霉素酰化酶，国际上对该酶的研究最近几年来成为新的热点，但是酶活表达量不高的瓶颈问题限制了其广泛应用。 主要研究内容： AfPGA基因重组菌的高活性表达的发酵优化及其中试生产； 从构建的四组重组菌中筛选出一株高活性表达的工程菌，目前通过对菌株的培养条件及培养基的多方面优化，3.7L发酵罐上酶活达70，000 U/L，已经远远超过国际上报道的最高水平，基本达到产业化的要求，并有继续提高的趋势。 AfPGA基因重组菌的高活性表达的分子调控机理研究； 拟从菌株产酶的分子机理方面考察并提高菌株产酶能力，揭示各环境因素对胞内前体酶、细胞间质包涵体及活性酶产生的影响。从微生物代谢网络角度优化产酶条件，预计3吨发酵罐上酶活能达80，000 U/L以上。 AfPGA的酶固定化及其固定化重组细胞的技术研究，开发可商品化的青霉素酰化酶制剂。 采用新型固定化介质（纳米多空材料等）和新型固定化方法（如交联酶聚集体）进行固定化酶和细胞的研究。使固定化载体国产化、固定化酶生产的各项指标在市场上具有较强的技术竞争力。 不同生物催化反应体系中固定化形式的酶源稳定性研究； 考察该酶在不同催化体系中的反应耐受性、重复利用率、催化效率等指标。重点考察非水相反应体系，建立该酶的催化技术平台。 利用青霉素酰化酶催化反应合成性价高的手性医药中间体，探索合成物质的新用途，并实现规模化制备的技术指标； 其中光学纯叔亮氨酸的制备实验各项指标良好，已进入中试扩大化阶段；头孢类抗生素尤其是头孢克罗合成已经完成中试，目前已有公司针对该产品进行洽谈；β-氨基酸、环二肽、氨基醇等目前的工艺路线已经打通，进展良好，有望取得较好的实验结果，并在成本和制备工艺等方面具有较好的产业化市场潜力。 最终实现目标： 1.AfPGA的发酵生产指标远远超过国际上报道的最高发酵水平，在3吨发酵罐上酶活达8万单位/L以上，实现项目的成功转让。 2.实现AfPGA固定化形式的商业化生产，成功技术转让。 3.建立该酶的催化反应技术平台；开发出一到两种能中试扩大化的高性价比目标产品。 二、项目主要研究技术的国内外发展现状与趋势 项目主要研究技术的国内外发展现状与趋势： AfPGA的发酵优化部分目前国内外普遍存在表达水平不高的问题，国内最高水平达3500 U/L(中国专利，公开号：CN1544635A)。在国外，目前报道的最高产量为2.31 g/L(Biotechnology Process,2005;21:432-438),而我们目前发酵的最高水平为2.45 g/L，酶活达70，000 U/L，高于目前报道最高值，已经基本达到产业化要求。通过相关的发酵机理研究和发酵技术的运用，预计产量还会有大的提高。 生物催化目前国内存在的瓶颈问题主要是固定化形式的生物催化剂不理想，酶活低、不稳定、重复利用率差。故绝大部分需直接进口或进口固定化载体后进行固定化，这是一个迫切解决的问题。本研究拟在本方向上有所突破。 青霉素酰化酶的催化反应体系虽然近年来研究较多，但是都是针对一具体的产物或反应进行实验，很难形成体系，参考价值不大。本研究拟在该酶的不同催化反应体系方面进行详细、系统的研究，形成具体的理论体系，建立不同催化反应的技术模式，为后续的研究者提供通用的催化技术平台。 虽然青霉素酰化酶已经被广泛应用于半合成抗生素的合成，但在手性医药中间体的利用和开发方面还较少，已有的报道文献或专利仅证明技术路线是可行的，但距离规模化制备还有一定的距离。本项目拟在这方面有所突破，实现性价比较高的几种手性医药中间体的规模化制备，并与化学法相比具有相当的竞争力甚至超过化学法。 项目主要研究技术国内外专利授权情况： 程仕伟等 2006 利用基因工程菌发酵生产粪产碱杆菌青霉素酰化酶；中国专 利，公开号： CN1821400 Quaedflieg et al. 2003 Synthesis and recovery of aspartame involving enzymatic deformylation step； US patent，6617127