分子标记技术.ppt

原理：1.利用一个随机引物(一般为10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段；2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分离；3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录RAPD指纹；4.进行DNA多态性分析。随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD技术流程：RAPD分子标记的应用RAPD技术已在苜蓿，豆类，番茄，辽东栎，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花，月季，牡丹，锦鸡儿，野大豆，桉树，玉米，水稻等多种植物中广泛应用。目前主要用于以下4个方面的研究：a：研究种质资源的亲缘关系和遗传背景。b：种质资源（含亲本材料）的分类。c：种质的遗传变异评价。d:核心种质筛选。基因连锁图的构建：Tulsieram等最早利用RAPD标记在胚乳组织进行白石杉的遗传学图构建，而后用相同的策略又相继构建了湿地松、欧洲赤松、火炬松等的遗传学图。新遗传资源的鉴定：李松涛等对抗锈病的两个小冰麦进行RAPD分析，从40个引物中筛选到一个与抗锈基因连锁的RAPD标记。分析结果有力地说明，小冰麦是从冰草获得抗锈基因的易位系。优点：技术简单，实验周期短，信息量大，检测速度快；DNA用量少；实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析；不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析；用一个引物就可扩增出许多片段，几乎覆盖整个基因组，而且不需要同位素，安全性好。随机扩增多态性DNA(RAPD)缺点：实验的稳定性和重复性差显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降；RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的重复性差。随机扩增多态性DNA(RAPD)3、简单重复序列标记—SSR

（simplesequenceRepeats）

简单序列重复(SSR)即微卫星DNA微卫星是指以少数几个核苷酸(1~6个)为单位多次串联重复的DNA序列。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。原理：由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成了每个位点的多态性。根据其两端的保守序列设计一对特异性引物，PCR扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基因型个体在这个SSR位点的多态性。简单序列重复(SSR)SSR基本步骤：(1)构建小片段或大片段的基因组。(2)筛选阳性克隆。通过传统的影印或挑单菌落点膜的方法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固定后，用标记过的序列重复寡核苷酸或含微卫星序列的探针与尼龙膜上的克隆点杂交，筛选出其中的阳性克隆。(3)测序、设计引物、优化PCR反应条件，获得的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑选后测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域的序列设计引物，优化PCR扩增的条件，获得稳定、可靠的SSR标记。应用是种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一，广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、种群遗传多样性、系统发生等研究领域。简单序列重复(SSR)微卫星标记的优缺点：

分布广泛、多态性丰富、杂合度高、通用性好以及扩增反应所需模板量少、重复性好，共显性遗传、检测方便、结果稳定。优点：缺点：SSR标记的建立首先要对为微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工合成设计引物以及标记的定位、作图等基础性究，因而其开发有一定的困难，费用也很高。4.扩增片段长度多态性标记—AFLP

AmplifiedFragmentLengthPolymorphism1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。定义由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。原理：AFLP是建立在基因组限制性片段基础上的PCR扩增。由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引