纯化前后半枝莲多糖的药效学研究.docVIP

PAGE PAGE 1 纯化前后半枝莲多糖的药效学研究 　　摘要：采用Sevage法纯化半枝莲（ScutellariabarbataD.Don）多糖，并通过苯酚-硫酸法测定多糖含量；进行急性毒性试验考察半枝莲多糖对小鼠的毒性；通过体内移植肿瘤试验测定不同剂量纯化前后半枝莲多糖对小鼠S180瘤的抑制作用。纯化后半枝莲多糖的纯度为49.99%；急性毒性试验表明800mg/kg及以下剂量半枝莲多糖对小鼠无毒。纯化后半枝莲多糖的抑瘤率低于半枝莲粗多糖，100mg/kg半枝莲粗多糖的抑瘤率为46.85%。 　　关键词：半枝莲（ScutellariabarbataD.Don）；多糖；纯化；急性毒性；抑瘤率 　　中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）03-0659-03 　　半枝莲（ScutellariabarbataD.Don），别名狭叶韩信草、并头草、牙刷草等，为唇形科黄芩属植物，以干燥全草入药，本品味辛、苦，性寒，归肺、肝、肾经，有清热解毒、散瘀止血、利尿消肿的功能，是一种常用中药[1]。研究表明，半枝莲水提物和醇提物有明显的抗肺癌、消化系统癌、肝癌、乳腺癌、绒膜上皮癌的活性。本研究采用Sevege法将纯度为30%的半枝莲多糖进行纯化，采用限量试验测定其体内急性毒性[2，3]，并比较纯化前后半枝莲多糖的抑瘤效果，为半枝莲多糖药效学评价和抗肿瘤作用与免疫作用机制研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　KM小鼠，体重（20.0±2.0）g，雌雄各半。半枝莲多糖（纯度30%），徐州弘康科技有限公司产品；黄芪多糖（APS），由哈尔滨商业大学博士后工作站提供；环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批生理盐水，哈尔滨三联药业有限公司，批号100921A14。氯仿，天津市耀华化学试剂有限责任公司，批正丁醇，天津市标准科技有限公司，批浓硫酸，哈尔滨市新达化工厂，批号101103；苯酚，廊坊市兴达化工有限公司，批H2O2，沈阳市新西试剂厂，批葡萄糖，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号2010223；0.01mol/LNaHCO3、0.001mol/LEDAE、无水乙醇，天津市永大化学试剂开发中心，批氨水，哈尔滨市新达化工厂，批号090524。 　　1.2试验方法 　　1.2.1半枝莲多糖样品的纯化[4-7]①除蛋白。取半枝莲多糖5g溶于100mL蒸馏水中，将20mLSevage液（氯仿与正丁醇体积比4∶1）加入多糖溶液中，混合物剧烈振摇5min后4000r/min离心10min，取上层水相反复操作6次。②氧化脱色。除去蛋白后的多糖溶液用体积分数30%的氨水调节pH8～9，加质量分数10%的双氧水50mL，置4℃冰箱24h。③除小分子物质。采用透析法除去小分子物质。④醇沉。将透析过的多糖溶液经70℃减压浓缩至25mL，待自然冷却后加入体积分数95%的乙醇调节乙醇体积分数为80%，放置1d。⑤干燥。将沉淀用适量无水乙醇、丙酮洗涤，干燥后得棕黄色半枝莲多糖粉末。 　　1.2.2多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[7-8]测定溶液中多糖的含量。①葡萄糖标准曲线的绘制。精确量取浓度分别为0、10、20、30、40、50、60μg/mL的葡萄糖标准溶液各1.0mL，用蒸馏水补足至2.0mL，加5%苯酚溶液1.0mL混匀，迅速加浓硫酸5.0mL，振摇2min。用蒸馏水作空白对照，室温放置20min，流水冲洗。用紫外分光光度计检测其在490nm处的吸光度。葡萄糖浓度在10～60μg/mL范围内浓度（C）与吸光度（A）呈良好的线性关系（图1），回归方程为A=0.013C+0.028，r=0.9979。②半枝莲多糖含量的测定[8-11]。配制浓度为100μg/mL的半枝莲多糖溶液，精确量取1.0mL，稀释后按绘制葡萄糖标准曲线的方法测其A490nm，计算多糖含量（以葡萄糖计）。 　　1.2.3半枝莲多糖溶液的制备将纯化前后的半枝莲多糖加生理盐水适量溶解，观察溶液均匀度，以不出现肉眼可见的小结晶颗粒的最大浓度作为半枝莲多糖体内试验的试剂[12]，制成32mg/mL的饱和溶液，并稀释成浓度分别为1、2、4、8、12、16mg/mL的溶液。 　　1.2.4急性毒性试验选用体重（20.0±2.0）g的健康KM小鼠10只，雌雄各半，以800mg/kg（32mg/mL，0.5mL/只）剂量腹腔注射给药，每天2次。给药后观察7d，观察期间逐日记录动物的毒性反应情况及死亡状况。 　　1.2.5半枝莲多糖抑瘤率的测定选用体重（20.0±2.0）g的健康KM小鼠150只，随机分为15组，每组10只，雌