第十三章 酶的应用及研究方法.ppt

第十三章 酶的应用及研究方法 提纲 一、酶的活力测定 酶活力的表示方法 酶活力测定的方法 二、酶的分离和纯化 三、酶工程 固定化酶 人工酶 定点突变酶 杂交酶 抗体酶 酶的活力 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶的催化能力。 酶活力单位的定义：1个U是指在最适条件下每分钟催化1微摩尔底物转化的酶量,或者1个katal（kat）被定义为每秒钟催化1分子底物转化的酶量（1 kat = 6×107U，1U=16.67×10-9kat）。 比活性或比活力（specific activity）来表示，它是指单位重量（通常是每毫克）酶所含有的活力单位数 酶活力测定的方法 测活基本原理： 测定一种酶的活力实际上就是测定它所催化的化学反应的最佳反应速度。而测定反应速度的方法原则上有两种，一种是检测单位时间内底物的减少量，另一种是测定单位时间内产物的增加量。 测活基本条件： 反应条件为最适条件，包括最适pH、最适温度和最适离子强度等 反应速度为初速度 底物浓度过量。 具体测定方法： 直接测定法（direct assay） 间接测定法（indirect assay） 偶联测定法（coupled assay） 酶纯化表（purification table） 酶溶液体积（ml） 酶溶液蛋白质含量（mg/ml） 酶溶液活性（U/ml） 酶总量或酶总活性（U）=酶活力（U/ml）×体积（ml） 比活性（U/mg）=酶活力（U/ml）/蛋白质量（mg/ml） 总蛋白（mg）=酶溶液蛋白质含量（mg/ml）×体积（ml） 得率（%）=每一步纯化后的酶总量/每一步纯化之前的酶总量×100%； 纯化倍数（purification factor）=每一步纯化后的酶比活性/每一步纯化之前的酶比活性。 固定化酶 是指将一种可溶性酶与不溶性的有机或无机基质结合，或者将其包埋到特殊的具有选择透过性的膜内，从而提高酶的稳定性、便于重复和持续使用。与可溶性酶相比，固定化酶具有方便、经济和稳定等优点。 人工酶 也称为人工合成酶（synzyme），它们一般是具有类似酶活力的合成多聚物或寡聚物，有时还包括具有酶活力的天然蛋白的衍生物。 杂交酶 现代分子生物学技术的发展已允许人们将两种不同的生物分子融合在一起，以获得具有新性质、新功能的杂合分子。杂交酶就是酶与其他生物分子融合在一起的产物。 * 细胞色素氧化酶活力的直接测定 二氢乳清酸脱氢酶的间接测定 己糖激酶活力的偶联测定 酶蛋白纯化的一般流程 酶纯化表示例 衍生于葡萄球菌核酸酶的蛋白质/核酸杂交酶 *