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苯诱发脂质过氧化代谢产物丙二醛的色谱分析方法建立和人群应用研究

一、丙二醛色谱分析方法建立

（一）实验材料与仪器

试剂：丙二醛标准品（纯度≥98%）、2,4-二硝基苯肼（DNPH，分析纯）、甲醇（色谱纯）、磷酸（分析纯）、超纯水（18.2MΩ?cm）。

仪器：高效液相色谱仪（配紫外检测器）、高速离心机、涡旋振荡器、超低温冰箱（-80℃）、固相萃取柱。

（二）样品前处理优化

衍生化反应：取血清/尿液样品0.5mL，加入0.2mLDNPH衍生液（0.05mol/L，磷酸调节pH=2.0），涡旋混匀后，37℃水浴避光反应30min（通过正交实验确定最佳反应温度与时间，确保MDA完全衍生为MDA-DNPH）。

净化步骤：衍生后样品加入1mL甲醇，涡旋1min，12000r/min离心10min，取上清液过固相萃取柱（预先用5mL甲醇、5mL超纯水活化），依次用3mL5%甲醇水溶液洗脱杂质，5mL纯甲醇洗脱目标物，收集洗脱液，过0.22μm有机滤膜，待测。

（三）色谱条件确定

色谱柱：C18反相柱（250mm×4.6mm，5μm）。

流动相：甲醇-水（70:30，v/v），等度洗脱（通过梯度洗脱对比实验，确定该比例下MDA-DNPH峰形对称、无杂质干扰）。

检测条件：流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长360nm（MDA-DNPH特征吸收波长），进样量20μL。

（四）方法学验证

线性关系：配制MDA标准品衍生液浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L，进样测定，以峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线，得回归方程y=1254.3x+28.6（R2=0.9998），线性范围0.1-10.0μmol/L，满足检测需求。

精密度：取低、中、高（0.5、2.0、8.0μmol/L）3个浓度标准品，日内连续测定6次，RSD为1.2%-2.5%；日间测定3天，RSD为2.1%-3.3%，精密度良好。

准确度：向空白血清样品中添加3个浓度MDA标准品，回收率为85.6%-92.3%（RSD4%），符合生物样品分析要求。

检出限与定量限：以3倍信噪比计算检出限（LOD）为0.03μmol/L，10倍信噪比计算定量限（LOQ）为0.1μmol/L，灵敏度满足人群样品中MDA的微量检测。

二、色谱分析方法的人群应用研究

（一）研究对象选择

暴露组：选取某石化厂苯作业工人120名（男85名，女35名，年龄25-50岁），苯暴露时长1-15年，空气中苯浓度经检测为0.5-8.0mg/m3（超过国家职业接触限值0.5mg/m3）。

对照组：选取非苯暴露健康人群100名（男68名，女32名，年龄23-48岁），无职业苯接触史，生活环境无苯污染。

排除标准：排除患有肝病、糖尿病、心血管疾病及近期服用抗氧化剂药物者。

（二）样本采集与检测

样本采集：所有研究对象空腹静脉采血5mL，离心分离血清（3000r/min，10min），-80℃保存；同时采集晨尿10mL，同样低温保存，1周内完成检测。

样品检测：采用已建立的高效液相色谱法测定血清及尿液中MDA含量，每个样品平行测定3次，取平均值。

（三）结果与分析

两组MDA含量对比：暴露组血清MDA浓度为（3.26±0.85）μmol/L，尿液MDA浓度为（2.89±0.72）μmol/L；对照组分别为（1.58±0.42）μmol/L、（1.35±0.38）μmol/L。暴露组MDA含量显著高于对照组（P0.01），表明苯暴露可诱导机体脂质过氧化，导致MDA生成增加。

MDA含量与苯暴露的相关性：将暴露组按苯暴露时长分为5年、5-10年、10年三组，结果显示，暴露时长越长，血清及尿液MDA含量越高（r=0.62、0.58，P0.01），呈正相关；同时，MDA含量与空气中苯浓度也呈正相关（r=0.55、0.51，P0.01）。

结论：建立的高效液相色谱法可准确检测人群样本中MDA含量，且应用该方法发现，苯暴露会显著升高机体MDA水平，MDA可作为苯致脂质过氧化损伤的潜在生物标志物，为苯职业暴露健康风险评估提供技术支持。