苏云金芽孢杆菌cry1Ab22基因的克隆与原核表达及应用潜力探究.docxVIP

苏云金芽孢杆菌cry1Ab22基因的克隆与原核表达及应用潜力探究

一、引言

1.1研究背景与意义

在农业生产的漫长历程中，病虫害始终是制约农作物产量与质量的关键因素。长期以来，化学农药凭借其高效的杀虫效果，在病虫害防治领域占据主导地位。然而，随着时间的推移，化学农药的诸多弊端逐渐显现。一方面，化学农药的过度使用导致害虫抗药性不断增强，使得防治成本逐年攀升，防治效果却大打折扣。例如，棉铃虫对多种传统化学农药产生了高度抗性，迫使农民不断加大用药剂量，进一步加剧了害虫抗性的恶性循环。另一方面，化学农药对环境的负面影响日益严重，其残留不仅污染土壤、水源和空气，还对非靶标生物造成伤害，威胁生态平衡。据相关研究表明，化学农药的大量使用导致许多有益昆虫数量锐减，破坏了生态系统的生物多样性。

在此背景下，生物农药作为一种绿色、环保的替代方案，受到了广泛关注。苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）作为微生物杀虫剂的典型代表，具有选择性强、安全环保、原料简单等显著优点，逐渐成为生物农药领域的研究热点和应用主体。Bt能够产生对害虫有毒性的蛋白质晶体，即伴胞晶体，这些晶体包含多种杀虫毒素，对鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等多个目的害虫具有毒杀作用，同时对线虫、螨虫、原生动物等也具有特异的杀虫活性。例如，在蔬菜种植中，苏云金芽孢杆菌制剂可有效防治小菜蛾、菜青虫等鳞翅目害虫，减少化学农药的使用，保障蔬菜的质量安全。

Bt的杀虫活性主要依赖于其携带的编码杀虫晶体蛋白（InsecticidalCrystalProteins，ICPs）的cry基因。cry基因家族庞大，不同的cry基因编码的蛋白质具有不同的杀虫谱和杀虫活性。随着Bt的广泛应用，害虫对其产生抗性的问题逐渐凸显，这对Bt的可持续应用构成了严重威胁。寻找新的高毒力cry基因，成为解决昆虫抗性问题、保障农业可持续发展的关键途径之一。

cry1Ab22基因作为cry基因家族的重要成员，具有独特的杀虫特性。克隆cry1Ab22基因并实现其原核表达，对于深入研究该基因的功能和作用机制，开发新型生物杀虫剂具有重要意义。通过原核表达获得大量的cry1Ab22蛋白，不仅可以为生物杀虫剂的大规模生产提供物质基础，还能为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料，有助于提高农作物的抗虫能力，减少化学农药的使用，降低农业生产成本，保护生态环境，推动农业向绿色、可持续方向发展。

1.2国内外研究现状

自1901年苏云金芽孢杆菌被首次发现以来，国内外学者对其进行了广泛而深入的研究。在cry基因的研究方面，取得了丰硕的成果。1981年，Schnept和Whiteley首次成功将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并实现表达，这一突破性进展开启了cry基因研究的新纪元。此后，越来越多的cry基因被陆续克隆和鉴定。截至目前，国际上已经克隆了数百种杀虫蛋白基因，cry基因家族不断壮大。

对于cry1Ab基因，其在苏云金芽孢杆菌的杀虫机制中发挥着重要作用，一直是研究的重点对象。cry1Ab22基因作为cry1Ab型基因的新成员，也逐渐受到关注。伍金元等从苏云金芽孢杆菌S249菌株中成功扩增到cry1Ab22基因，并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中，转化大肠杆菌TB1进行诱导表达，对表达产物的杀虫活性进行检测，发现该基因表达的蛋白对小菜蛾具有较强的杀虫活性。

尽管cry基因的研究取得了显著进展，但仍存在一些亟待解决的问题。一方面，随着Bt生物杀虫剂和转基因抗虫作物的广泛应用，害虫对cry蛋白的抗性问题日益严重，这使得cry基因的应用面临挑战。例如，小菜蛾对部分cry蛋白已经产生了明显的抗性，导致防治效果下降。另一方面，对于一些新发现的cry基因，如cry1Ab22，其功能和作用机制尚未完全明确，需要进一步深入研究。此外，cry基因在不同宿主中的表达效率和稳定性也有待提高，这对于实现其大规模应用至关重要。

1.3研究目的与内容

本研究旨在克隆苏云金芽孢杆菌cry1Ab22基因，并实现其在原核系统中的高效表达，为开发新型生物杀虫剂和抗虫转基因产品提供理论基础和技术支持。具体研究内容如下：

苏云金芽孢杆菌cry1Ab22基因的克隆：根据GenBank中已公布的cry1Ab型基因序列，设计特异性引物，采用PCR技术从苏云金芽孢杆菌菌株中扩增cry1Ab22基因。对扩增得到的基因片段进行测序和序列分析，确定其核苷酸序列和氨基酸序列，并与已报道的cry1Ab基因进行同源性比较。

原核表达载体的构建：将克隆得到的cry1Ab22