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2025年免疫学实验操作技巧检测及答案解析

一、流式细胞术多色标记与补偿设置操作检测

操作题目：使用BDFACSymphonyA5光谱流式细胞仪检测人外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）比例，需完成以下步骤：1.PBMC分离与活力染色；2.表面抗原CD4、CD25标记；3.胞内抗原Foxp3标记；4.补偿设置与样本采集；5.数据初步分析。请描述关键操作细节、常见错误及解析。

关键操作细节：

1.PBMC分离：使用密度梯度离心时，需将稀释全血（1:1PBS）沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液（如Ficoll-PaquePLUS）液面，保持清晰界面；离心条件为800g、20℃、20分钟（无刹车），避免加速或减速时界面破坏。活力染色选择可固定的活/死染料（如ZombieAqua），染色浓度为1:1000，37℃避光孵育15分钟，避免固定后染料渗透导致假阳性。

2.表面抗原标记：表面抗体（CD4-APC-Cy7、CD25-PE-CF594）需经预实验优化浓度（推荐使用抗体滴定板确定EC80浓度）；染色体积为100μL/管（细胞浓度1×10^6/mL），4℃避光孵育30分钟，避免37℃导致抗体内化。洗涤时用含2%FBS的PBS（FACSBuffer），1500g离心5分钟，弃上清时保留50μL避免细胞丢失。

3.胞内抗原标记：使用BDCytofix/Cytoperm固定破膜液，固定15分钟后用Perm/WashBuffer洗涤2次；Foxp3抗体（Foxp3-APC）需用破膜缓冲液稀释（避免PBS导致抗体沉淀），4℃孵育45分钟；破膜后避免剧烈吹打，防止细胞破裂释放核蛋白干扰。

4.补偿设置：光谱流式需制备单染补偿微球（如BDCompBeads），每管微球分别标记单一荧光素（APC-Cy7、PE-CF594、APC、ZombieAqua），未标记微球作为阴性对照；采集时设置“SingleStain”模板，确保每个荧光通道仅1种荧光素激发；软件自动计算光谱重叠矩阵，手动验证补偿后各单染样本在非对应通道的信号应≤1%阳性率。

5.数据采集：设置前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）的电压，使淋巴细胞群位于FSC-A/SSC-A散点图的中左区域；设置活细胞门（ZombieAqua阴性），排除死细胞及碎片（FSC-A/SSC-A低信号）；采集速度控制在500-1000事件/秒，避免细胞簇导致的信号重叠。

常见错误及解析：

-错误1：PBMC分离时离心速度过高（1000g）或使用刹车，导致界面模糊，单核细胞与粒细胞混杂。解析：高离心力或刹车会破坏分层，粒细胞（密度高于Ficoll）会进入PBMC层，影响后续Treg比例（粒细胞无CD4表达但可能非特异性结合抗体）。

-错误2：表面抗体未滴定，使用过高浓度导致非特异性结合（如CD25-PE-CF594在CD4阴性细胞上出现假阳性）。解析：抗体过量会与Fc受体非特异性结合，需通过滴定实验确定最佳浓度（如使用同型对照或未标记样本，确保阳性群MFI/阴性群MFI5）。

-错误3：胞内标记时破膜不充分，Foxp3染色呈阴性。解析：破膜液（含0.1%皂素）需完全溶解细胞膜胆固醇，若固定时间过长（20分钟）或破膜缓冲液稀释过度（如用PBS代替Perm/WashBuffer），会导致核膜未打开，抗体无法进入胞内。

-错误4：补偿设置时使用细胞单染样本而非微球，导致补偿偏差（如APC-Cy7在PE-CF594通道残留信号未完全扣除）。解析：细胞表面抗原表达量差异大（如CD4高表达细胞APC-Cy7信号强，低表达细胞信号弱），微球表面抗原位点均一，能更准确反映荧光素间的光谱重叠。

二、ELISA双抗体夹心法检测人IL-6浓度操作检测

操作题目：使用RDSystemsHumanIL-6ELISAKit检测血清样本中IL-6浓度，需完成以下步骤：1.包被板预处理；2.标准品与样本稀释；3.加样与孵育；4.洗涤与检测抗体孵育；5.显色与终止；6.标准曲线绘制与浓度计算。请描述关键参数控制、易忽视细节及误差来源解析。

关键参数控制：

1.包被板预处理：试剂盒提供的预包被板（捕获抗体已包被）需平衡至室温（25℃），避免低温导致抗体变性；开封后未使用的板条需用自封袋密封，加入干燥剂（如硅胶），4℃保存不超过1个月（避免潮解导致抗体脱落）。

2.标准品稀释：重组IL-6标准品（1000pg/mL）需用样本稀释液（含BSA和叠氮钠）进行倍比稀释（推荐稀释梯度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/m