基因克隆和表达的载体.pptVIP

*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*Ⅱ.修饰酶切识别位点天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI5个，HindIII7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λDNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*λ-DNA的抽提1)大肠杆菌培养至对数生长期（在含有乳糖的培养基中）

2)加入λ-噬菌体或重组λ－噬菌体悬浮液，37℃培养1小时

3)用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时

4)高速离心，沉淀噬菌体

5)苯酚抽提，释放λ-DNA

6)乙醇或异丙醇沉淀DNA3.3.2.3重组?DNA分子的体外包装入噬菌体DNA必须进行体外包装，才能成为有活性的病毒颗粒。入噬菌体的包装容量为野生型入噬菌体DNA（48kb）的75％～105％，即约36.4~51kb.从入噬菌体突变株感染的溶原菌株，提取噬菌体包装所需的全部蛋白质。2005年8月11日6时44分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*3.3.2.4?噬菌体载体的评价λ-DNA作为载体的优点1)λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌2)λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量3)重组λ-DNA的筛选较为方便,可进行正向筛选和杂交筛选。4)重组λ-DNA分子的提取比质粒容易操作较复杂*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*3.3.3柯斯质粒载体或称粘粒(cosmid)cosmid:cossite-carryingplasmid杂种质粒是一类人工构建的含有入DNAcos位点、噬菌体包装有关的DNA短序列（具有噬菌体的高感染性）、质粒DNA复制子、抗生素标记基因等元件的特殊质粒载体。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide**欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*（一）考斯质粒的构建λ-DNA载体的最大装载量为25kb,有的往往需要构建克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒就是应这种需要而人工组建的。考斯质粒顾名思义就是含有λ-DNA两端cos区的质粒。由于λ-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象λ-DNA一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，考斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*Cos质粒pJB8（二）Cosmid载体的特点为双链环状DNA分子。分子小，约4—6kb，可容纳大～40kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因组文库。具有质粒的特性，可以转化大肠杆菌，并按质粒的复制方式进行复制和增殖。具有?噬菌体的特性，在体外进行包装后，可高效转导大肠杆菌，但不能进入溶菌和溶原生长，不能产生子代噬菌体。含有抗药性基因，可进行插入失活筛选。由于非重组体很小，不能在体外包装,因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*3.3.4M13单链丝状噬菌体载体（一）M13单链噬菌体的分子生物学：M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然后以负链为模板，滚筒式复制串联式上链分子，当拷贝数达到100-200时，负链上的基于产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*M13噬菌体的侵染循环*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide*（二）M13-DNA载体家族