基因的化学合成法.PPTVIP

环境生物化学⑵λ噬菌体载体λ噬菌体的生活周期包括溶菌周期和溶原周期：当λ噬菌体侵入大肠杆菌后，可以在细菌内扩增，并使细胞裂解，释放出大量的噬菌体颗粒；也可通过溶原途径，使其DNA整合到大肠杆菌的染色体上，以前噬菌体的形式潜伏下来。在某些特定条件下，整合的λ噬菌体被切割下来，进入裂解周期环境生物化学λ噬菌体感染途径环境生物化学 λ噬菌体的基因组DNA长约48kb，在宿主体外与蛋白质结合包装为含有双链线状DNA分子的颗粒。由于受到包装效率的限制，其连接目的基因后的总长度应为λ噬菌体基因组总长度的75％一105％，超过这一范围，重组噬菌体的活力会大大降低。环境生物化学 根据克隆的方式不同，λ噬菌体载体可以分为插入型载体和取代(置换)型载体两类：插入型载体适合克隆6-8kb大小的DNA片段，常用于cDNA的克隆或cDNA文库的构建，如：λgt10、λgtll等；置换型载体可以允许插入长度达30kb的外派DNA片段，因而适用于基因组DNA的克隆及基因组DNA文库和cDNA文库的构建，典型代表为EMBL系列和Charon系列载体。环境生物化学⑶黏性质粒与人工染色体 黏性质粒(Cosmid)又叫柯斯质粒，它是由质粒和λ噬菌体的cos黏性末端构建而成的载体系列。黏粒大小为4—6kb，兼有λ噬菌体和质粒两方面的优点，可以克隆31—45kb的外源DNA片段，而且能被包装成为具有感染能力的噬菌体颗粒。黏粒主要用于真核细胞基因组文库的构建。环境生物化学 人工染色体是为了克隆更大的DNA片段而发展起来的新型载体，其中YAC(酵母人工染色体)是在酵母细胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆载体。YAC可以接受100—2000kb的外源DNA的插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。另外还有BAC(细菌人工染色体)以及目前正在发展的MAC(哺乳动物人工染色体)，这些载体在人类基因组计划和其他基因组项目中起到了关键性作用。环境生物化学 上述载体主要为克隆载体，用于目的基因的克隆、扩增、序列分析及体外定点突变等。为了在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物而应用的载体被称为表达载体。表达载体除了含有克隆载体中的主要元件外，还含有表达目的基因所需要的各种元件环境生物化学5.3.4基因工程工具酶 ⑴限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶，简称为限制酶，是能够识别和切割双链DNA中特定核苷酸序列的一类核酸酶。限制性内切酶与甲基化酶共同构成细菌的限制—修饰体系，其功能为限制(切割)外源DNA和保护自身DNA，维持细菌自身遗传性状的稳定。环境生物化学限制性核酸内切酶，按照其对辅助因子的需求和切割双链DNA的特性，可以分为I、Ⅱ和Ⅲ型，三种不同的限制性核酸内切酶具有不同的特性环境生物化学基因工程技术中所用的主要是Ⅱ型限制性内切酶，其特点为：识别与切割特定的核苷酸序列，因而产生特异性切口。Ⅱ型限制性内切酶的识别序列常为4—6个核苷酸的回文结构，即同一条单链以中心轴对折可形成互补的双链。限制性内切酶消化后的DNA可以形成没有单链突出的末端，称为平端或钝端，如：SmaⅠ；也可以形成有单链突出的所谓黏性末端。黏性末端中有5＇＇突出的黏性末端，如：BamHⅠ;也有3＇突出的黏性末端环境生物化学限定性内切酶切割DNA产生的DNA片段末端环境生物化学⑵DNA聚合酶 DNA聚合酶催化以DNA为模板合成DNA的反应，在基因工程技术中用于DNA的体外合成。经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KIenow酶)、T4DNA聚合酶及耐高温DNA聚合酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是，它们都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3＇-羟基末端上。环境生物化学 该酶具有3种活性：5＇→3＇聚合酶活性、5＇→3＇外切酶活性及3＇→5＇外切酶活性。它在分子克隆中主要用于制备供核酸分子杂交用的放射性同位素标记的DNA探针。 ①大肠杆菌DNA聚合酶I环境生物化学 它是由大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)经枯草杆菌蛋白酶处理后产生出来的大片段分子。Klenow聚合酶仍具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，但是失去了5＇→3＇外切酶活性，主要用于填补经限制酶消化所形成的DNA3＇-末端、合成cDNA的第二链及DNA序列的测定。②K1enow聚合酶环境生物化学③热稳定DNA聚合酶 aqDNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子质量为65ku，最佳反应温度为70℃。TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链反应(pCR)。环境生物化学酶在污染治理中的应用来自于很多种植物的微生物酶在一系列的废水处理应