纤维素葡聚糖凝胶.PPTVIP

2、离子交换剂的处理酸碱浸泡进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。水悬浮去除杂质和细小颗粒(二)装柱一般以直径与长度之比为1：15为宜当样品量多且组分复杂时，可选用稍长的柱子用起始缓冲液充分滴注洗脱，至流出液与进柱前溶液有相同的pH应注意离子交换树脂在柱中均匀分布(三)加样加样前，样品应预先对起始缓冲液充分透析平衡(四)洗脱①增加缓冲液离子强度②改变pH③同时改变离子强度与pH洗脱的方式①一步洗脱法②分段洗脱法③梯度洗脱法：用浓度(或pH)连续改变的洗脱液进行洗脱。洗脱速度洗脱速度通常要保持恒定洗脱速度慢比快的分辨率好如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。洗脱液的监测收集及组分鉴定监测用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收收集用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等离子交换剂的清洗、再生和保存可溶于碱的污染物0.1mol/LNaOH洗涤Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤结合缓冲液洗涤可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。对于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤可以除去脂类和其他的疏水性物质。→→金属污染物EDTA饱和的10mmol/LHCL（即pH=2）处理柱子沉淀物杂质去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6mol/L的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。再生对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。酸碱交替浸泡保存处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02%的叠氮钠，4°C下保存。第三节亲和层析技术亲和层析(affinitychromatography)是利用生物分子间的亲和吸附和解吸而设计的层析方法，即通过固定于水不溶性的固相支持物(载体)上的互补物(配体)的特异性，可逆性的吸附而使物质分离。该层析条件温和，过程简单，纯化的倍数高，对分离含量低又不甚稳定的生物活性物质极为有效专门的吸附剂，并寻找一种专门的层析条件方能进行工作。一、亲和层析的基本原理生物大分子具有和某些相对应的专一分子(一般为结构上与其相应的分子)相结合的特性这种结合既是特异性的，又是可逆性的；改变条件又能使这种结合解除生物分子间的这种结合能力，称为亲和力酶的活性部位和底物、抑制剂、辅助因子酶的变构中心与变构因子(或称效应物)之间抗原与抗体之间激素与受体之间核糖核酸与其互补脱氧核糖核酸之间亲和力生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。分离原理通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。基本操作凝胶的选择凝胶柱的制备上样洗脱凝胶柱的重复使用与保存三、凝胶过滤层析的实验技术(一)凝胶的选择与处理根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的进行选择1.分离分子量相差悬殊的两种物质，如蛋白质脱盐2.纯化蛋白质时，则需要根据各组分的分子量分布范围及各种凝胶的分离范围选用合适的凝胶粗粒，中粒：分离效果差，但流速快，可用于工业上物质的制备细粒：洗脱曲线峰形对称、峡窄、分离度好超细颗粒：能给予最好分离，但流速慢，实验时间长(二)层析柱的选择柱子要直，内径均一；下端死区小柱的有效长度越大，洗脱峰之间的距离则越宽，分辨率越高。过细的柱子，会因管壁效应而影响分离效果柱层析的L/d比值2、凝胶柱的制备用于分组分离短而粗L/D值＜10用于分级分离L/D值比较大对很难分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1～5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。柱L/D值的选择装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。凝胶柱填装后通常可以采用一种