PCR技术原理与应用.pptxVIP

实验室分子生物学检测技术;一、PCR的基本原理

二、荧光定量PCR的基本原理

三、应用：高致病性猪蓝耳病RT-PCR操作方法;

一、PCR的基本原理;;PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。模拟了发生在细胞内的DNA复制的过程。;DNA的复制(replication)

——由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。;（1）变性(Denature):目的双链DNA模板在高温下解链。

;基本步骤:;;（1）以DNA为模板的反应

10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加DEPC水至100ul

;（2）以mRNA为原始模板进行的PCR反应称为逆转录PCR,RT-PCR

a.逆转录反应体系

体积：20μl

缓冲液

底物：4种dNTP

引物：oligo(dT)

模板：RNA

逆转录酶

b.PCR反应体系同以DNA模板的反应体系;参加PCR反应的物质主要有五种:

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+;引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。;设计引物应遵循以下原则：;2.酶;dNTPs浓度在20~200μmol/L,dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。;PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环，即RT-PCR。

传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用。

近几年来也发展了些简便实用较为有效的标本消化处理方法，如柱式提取法，亦可满足PCR实验的要求。;5.Mg2+;变性温度和时间：93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

退火温度和时间：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合，30s~1min。

延伸温度和时间：72℃，时间因扩增片段的长度而异：一般1kb以内，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

循环次数：30~40次;;(1)标本间交叉污染

(2)PCR试剂的污染

(3)PCR扩增产物污染。这是最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

;还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染加样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.

(4)实验室中克隆质粒的污染:用克隆质粒做阳性对照的检验室这个问题也比较常见。

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PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区扩增区电泳区

严禁器材和试剂倒流！

实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA;1.模板提取区这个区域专门用于制备模板提取核酸，

⑴PCR产物和带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个区域操作。

⑵用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。

⑶在提取DNA样品和RNA样品时要带手套，并要经常更换。

⑷纯化样品对污染的风险有极大的影响。

;⑴所用的所有试剂盒耗材应该经DEPC处理，去除核酸和核酸酶；

⑵所用PCR试剂中的水都是