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多抗性猪源大肠杆菌部分耐药性基因分析

一、引言

猪源大肠杆菌作为兽医临床常见病原菌，在养猪业中扮演着极为关键的角色。在自然环境里，大肠杆菌广泛分布，猪肠道便是其重要的栖息之所。不过，部分猪源大肠杆菌具有致病性，会引发多种严重疾病，其中仔猪黄痢、白痢以及猪水肿病最为常见。这些疾病不仅会导致仔猪生长发育受阻，严重时甚至会造成仔猪死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。

在现代养猪业中，抗生素的应用十分广泛。它在预防和治疗猪病、促进猪生长等方面发挥了重要作用。但随着抗生素的大量、不合理使用，细菌耐药性问题愈发严重。猪源大肠杆菌耐药菌株不断涌现，尤其是多重耐药菌株的出现频率显著上升。这使得仔猪黄痢、白痢等疾病的防治工作变得异常艰难，临床治疗效果大打折扣。若耐药菌株通过食物链等途径传播给人类，还会对公共卫生安全构成严重威胁，增加人类感染耐药菌的风险，使临床治疗面临更大挑战。

为了解决猪源大肠杆菌耐药性这一难题，深入研究其耐药机制迫在眉睫。通过对猪源大肠杆菌临床分离菌株的耐药性表型及部分耐药基因进行检测与分析，能够为临床合理用药提供科学指导。兽医和养殖户可以依据检测结果，精准选择有效的抗生素，避免盲目用药，从而提高治疗效果，减少抗生素的滥用。对耐药基因的研究还有助于开发新的抗菌药物和治疗方法，为养猪业的健康发展和公共卫生安全提供有力保障。

二、材料与方法

（一）样本采集与菌株鉴定

从湖南、贵州、四川、江西、湖北等多个省份的规模化猪场，采集了共计99份样本。这些样本包括病猪的肠道内容物、粪便以及猪场污水。在采集过程中，严格遵循无菌操作原则，确保样本不受外界污染。对于每一份样本，都详细记录了采集地点、猪只品种、日龄、发病症状等信息，为后续研究提供全面的数据支持。

采集到的样本迅速被送往实验室，进行菌株的分离与鉴定。首先，将样本接种于LB培养基中，在37℃的恒温培养箱中进行富集培养18-24小时。LB培养基富含多种营养成分，能够为大肠杆菌的生长提供充足的养分。经过富集培养后，采用伊红美蓝琼脂平板划线法进行单菌落分离。伊红美蓝培养基含有伊红和美蓝两种染料，大肠杆菌在该培养基上生长时，会分解乳糖产酸，使菌落染上伊红和美蓝的颜色，呈现出具有金属光泽的紫黑色菌落，便于与其他杂菌区分。挑取疑似大肠杆菌的单菌落，进行革兰氏染色、形态学观察以及一系列生理生化试验。在革兰氏染色中，大肠杆菌被染成红色，呈现出革兰氏阴性菌的特征。通过显微镜观察，其形态为短小的杆菌，两端钝圆。生理生化试验包括IMViC试验（吲哚试验、甲基红试验、VP试验和枸橼酸盐利用试验）以及多种糖发酵试验。在吲哚试验中，大肠杆菌能够分解色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基上层会出现玫瑰红色环；甲基红试验中，由于大肠杆菌发酵葡萄糖产生大量酸性物质，使培养基pH值降低，加入甲基红指示剂后呈现红色；VP试验则为阴性；枸橼酸盐利用试验中，大肠杆菌不能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，培养基颜色不变。在糖发酵试验中，大肠杆菌能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖等多种糖类产酸产气，使培养基中的指示剂变色并产生气泡。经过这一系列严谨的鉴定流程，最终从99份样本中成功分离并确认了27株猪源大肠杆菌。

（二）药敏试验与耐药表型分析

为了全面了解这些大肠杆菌菌株的耐药情况，选取了临床常用的32种抗生素进行药敏试验。这些抗生素涵盖了头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、大环内酯类、酰胺醇类和林可胺类等8大类。头孢类抗生素如头孢噻肟、头孢曲松等，通过抑制细菌细胞壁的合成来发挥抗菌作用；氨基糖苷类的庆大霉素、卡那霉素等，主要作用于细菌核糖体，影响蛋白质合成；喹诺酮类的恩诺沙星、环丙沙星，抑制细菌DNA旋转酶，阻碍DNA复制。将这些抗生素制成药敏纸片，采用Kirby-Bauer琼脂扩散法进行药敏试验。具体操作如下：将分离得到的大肠杆菌菌株接种于MH培养基平板上，用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁旋转挤去多余菌液后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周。待平板置室温下干燥3-5分钟后，用纸片分离器或无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。将平板置于35℃孵育箱中孵育16-18小时后，观察并测量抑菌圈直径。根据抑菌圈直径的大小，依据CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）标准判定菌株对各种抗生素的敏感性。当抑菌圈直径大于或等于特定数值时，判定为敏感；小于特定数值时，判定为耐药；处于两者之间的，判定为中介。通过对药敏试验结果的分析，筛选出对≥3类抗生素耐药的多重耐药菌株。

（三）