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中国部分省区猪瘟病毒E0基因分子流行病学特征及进化分析

一、引言

（一）猪瘟的危害与流行病学现状

猪瘟作为一种严重危害全球养猪业的烈性传染病，给养猪业带来了巨大的经济损失。其病原体猪瘟病毒（CSFV）属于黄病毒科瘟病毒属，是一种单股正链RNA病毒。近年来，随着养猪业的规模化发展，猪瘟的传播范围也在不断扩大，给疫情防控带来了更大的挑战。

在我国，部分省区猪瘟疫情呈现出非典型化趋势，这使得疫情的监测和防控工作变得更加复杂。非典型猪瘟的症状不明显，容易被忽视，从而导致疫情的扩散。此外，猪瘟病毒的变异也给疫苗的研发和应用带来了困难。因此，深入了解猪瘟病毒的分子流行病学特征，对于制定有效的防控策略具有重要意义。

（二）E0基因的研究意义

E0基因是猪瘟病毒的重要结构基因之一，它编码的E0蛋白具有多种生物学功能。E0蛋白不仅是病毒包膜的重要组成部分，还具备核酸酶活性，能够降解病毒和细胞的RNA。这种核酸酶活性对于病毒在宿主体内的持续感染和复制具有重要作用。

研究表明，E0蛋白的RNase活性位点高度保守，但其核苷酸序列在流行毒株中存在变异。这些变异可能会影响病毒的免疫逃逸能力和致病力。通过分析不同省区CSFV毒株的E0基因变异规律，我们可以揭示病毒的遗传演化路径和地域传播特征，为精准防控提供理论依据。此外，E0蛋白还能够诱导机体产生中和性抗体，是猪瘟病毒免疫应答的重要靶标之一。因此，研究E0基因的分子流行病学特征，对于开发新型疫苗和诊断方法也具有重要意义。

二、材料与方法

（一）样本采集与病毒分离

本研究选取了广西、山东、陕西等猪瘟流行较为严重的省区，在这些地区的规模化猪场、散养户以及屠宰场等地采集病料。采集的病料主要包括脾脏、扁桃体、淋巴结等组织，这些组织是猪瘟病毒感染后病毒含量较高的部位。采集过程严格遵循无菌操作原则，确保病料不受污染。

采集到的病料迅速置于冰盒中保存，并在24小时内送往实验室进行处理。在实验室中，将病料剪碎，加入适量的无菌生理盐水，研磨成匀浆。随后，以1000g的离心力离心15分钟，取上清液备用。

将处理后的上清液接种于PK-15细胞中进行病毒分离。PK-15细胞是一种对猪瘟病毒敏感的细胞系，能够支持病毒的生长和繁殖。接种前，先将PK-15细胞培养至对数生长期，然后将细胞悬液以1000g的离心力离心10分钟，弃上清液，用含有5%胎牛血清、无BVDV抗体、56℃灭活30分钟、0.3%谷氨酰胺、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL的EMEM生长液悬浮细胞，使细胞浓度为2×10^6/mL。将9份细胞悬液与1份病料上清液混合，接种于含细胞玻片的莱顿氏管或其它适宜的细胞培养瓶中，每管接种0.2mL。同时，设置3支莱顿氏管接种细胞悬液作为阴性对照，另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作为阳性对照。

将接种后的细胞培养物置于37℃、5%CO?的培养箱中培养。分别在培养24、48、72小时后，取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物，取出细胞玻片，用磷酸缓冲盐水（PBS液，pH7.2，0.01M）或生理盐水洗涤2次，每次5分钟，用冷丙酮（分析纯）固定10分钟，晾干后采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测。若荧光较弱或为阴性，则按上述步骤将组织上清细胞培养物进行病毒盲传，直至检测到阳性结果。通过这种方法，成功分离出多株猪瘟病毒，并结合RT-PCR技术对分离的病毒进行鉴定，确定为CSFV阳性样本。

（二）E0基因扩增与序列测定

为了深入研究猪瘟病毒E0基因的特征，我们设计了特异性引物，用于扩增E0全基因片段。引物的设计依据GenBank中已发表的CSFV全基因组序列，通过Oligo软件进行优化，确保引物的特异性和扩增效率。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，将其稀释成25pmol/μL，置-20℃分装保存备用。

采用RT-nestedPCR技术进行E0基因的扩增。首先，提取病毒RNA。按天根生化有限公司总RNA提取试剂盒方法提取病毒RNA，最后溶于30μLddH?O中。然后，进行反转录合成病毒cDNA。将获得的病毒RNA根据M-MLV反转录酶产品说明书进行操作，反应体系为5×M-MLVRTaseReactionbuffer4μL、RNA模板1μg、Random6-mers1μL、dNTPMixture（10mMeach）1μL、M-MLVRTase（200U/μL）1μL、RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，加RNaseFreedH?O至20μL。反