DBS52- 037-2018 食品安全地方标准 蔬菜中阿维菌素残留的测定 酶联免疫吸附法.docxVIP

DBS520372018食品安全地方标准蔬菜中阿维菌素残留的测定酶联免疫吸附法

1.范围

本标准规定了蔬菜中阿维菌素残留量的酶联免疫吸附测定方法。

本标准适用于白菜、菠菜、芹菜、黄瓜、番茄、辣椒等新鲜蔬菜中阿维菌素残留量的测定。

本方法的检出限为0.005mg/kg，定量限为0.01mg/kg。

2.原理

试样中的阿维菌素用乙腈提取，经正己烷液液分配净化，浓缩后用酶联免疫吸附法测定。阿维菌素与酶标板上固定的抗体特异性结合，加入酶标记的二抗和底物后产生显色反应，通过酶标仪测定吸光度值，根据标准曲线计算试样中阿维菌素的含量。

3.试剂和材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。

3.1试剂

3.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。

3.1.2正己烷（C6H14）：色谱纯。

3.1.3甲醇（CH3OH）：色谱纯。

3.1.4氯化钠（NaCl）。

3.1.5无水硫酸钠（Na2SO4）：650℃灼烧4h，冷却后贮于干燥器中备用。

3.1.6磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。

3.1.7磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）。

3.1.8氯化钾（KCl）。

3.1.9吐温20（Tween20）。

3.1.10过氧化氢尿素（ureahydrogenperoxide）。

3.1.11四甲基联苯胺（TMB）。

3.1.12浓硫酸（H2

3.2溶液配制

3.2.1磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）：称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钠，溶于800mL水中，用盐酸调节pH至7.4，加水定容至1000mL，4℃保存备用。

3.2.2PBST洗涤液：取1000mLPBS溶液，加入0.5mL吐温20，混匀后4℃保存备用。

3.2.3底物缓冲液（pH5.0）：称取1.84g柠檬酸、2.92g磷酸氢二钠，溶于80mL水中，用盐酸调节pH至5.0，加水定容至100mL，4℃保存备用。

3.2.4TMB显色液：称取10mgTMB溶于1mL二甲基亚砜中，加入9mL底物缓冲液，混匀后避光保存，现用现配。

3.2.5终止液：取2mL浓硫酸缓慢加入98mL水中，混匀后室温保存。

3.2.6阿维菌素标准储备液（1mg/mL）：准确称取10.0mg阿维菌素标准品（纯度≥95%），用甲醇溶解并定容至10mL，20℃保存，有效期6个月。

3.2.7阿维菌素标准工作液：用甲醇将标准储备液逐级稀释至1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL系列浓度，4℃保存，有效期1个月。

3.3材料与耗材

3.3.1阿维菌素酶联免疫试剂盒：包括酶标板（预包被阿维菌素抗体）、阿维菌素标准品、酶标记物、底物、浓缩洗涤液、终止液等。

3.3.2聚丙烯离心管：50mL，15mL。

3.3.3具塞刻度试管：10mL。

3.3.4分液漏斗：250mL。

3.3.5旋转蒸发仪及配套设备。

3.3.6氮吹仪。

3.3.7涡旋混合器。

3.3.8离心机：转速≥4000r/min。

3.3.9电子天平：感量0.1mg。

3.3.10酶标仪：配备450nm滤光片。

3.3.11微量移液器：10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL。

3.3.12有机系微孔滤膜：0.22μm。

3.3.13玻璃器皿：烧杯、量筒、容量瓶等。

4.分析步骤

4.1试样制备

取具有代表性的新鲜蔬菜样品，去除不可食部分，用干净纱布擦去表面泥土，切碎后用组织捣碎机匀浆，装入洁净容器中，密封后于18℃冷冻保存备用。

4.2提取

称取5.0g（精确至0.01g）试样于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL乙腈，涡旋混合2min，以4000r/min离心5min，将上清液转移至250mL分液漏斗中。残渣用10mL乙腈重复提取一次，合并上清液。

4.3净化

向分液漏斗中加入20mL正己烷，振摇2min，静置分层，弃去上层正己烷相。下层乙腈相转移至100mL鸡心瓶中，加入5g无水硫酸钠脱水，于40℃水浴中旋转蒸发至近干。用2mL甲醇溶解残渣，经0.22μm有机系微孔滤膜过滤，供酶联免疫分析用。

4.4测定

4.4.1酶标板准备：取出预包被酶标板，恢复至室温（2025℃），每孔加入50μLPBST洗涤液，静置1min后弃去，重复洗涤3次。

4.4.2加样：每孔加入50μL标准工作液或试样提取液，每个浓度设3个平行，同时设置空白对照（甲醇）和阴性对照。轻轻振荡混匀，37℃孵育30min。

4.4.3洗涤：弃去孔内液体，每孔加入200μLPBST洗涤液，静置1m