DB13-T 1115-2009 食品中军团菌的测定.docxVIP

DB13T食品中军团菌的测定

1范围

本标准规定了食品中军团菌的测定方法。

本标准适用于各类食品中军团菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.1食品卫生微生物学检验总则

GB4789.2食品卫生微生物学检验菌落总数测定

GB4789.3食品卫生微生物学检验大肠菌群测定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1军团菌Legionella

一类革兰氏阴性、需氧、有鞭毛的杆菌，广泛存在于自然环境和人工水系统中，可引起人类军团菌病。

3.2军团菌病Legionellosis

由军团菌引起的急性呼吸道传染病，临床表现为肺炎型（军团病）和非肺炎型（庞蒂亚克热）两种类型。

4原理

本标准采用选择性培养基分离培养法，结合生化反应和血清学鉴定技术进行军团菌的检测。样品经过前处理后，在选择性培养基上进行培养，可疑菌落通过生化试验和血清学试验进行确认。

5试剂和材料

5.1培养基和试剂

5.1.1BCYEα培养基：按照GB4789.1规定的方法制备。

5.1.2L半胱氨酸缺失的BCYEα培养基：按照GB4789.1规定的方法制备。

5.1.3革兰氏染色液：按照GB4789.1规定的方法制备。

5.1.4生化反应试剂：氧化酶试剂、触酶试剂、马尿酸盐水解试剂等。

5.1.5血清学试剂：军团菌分型血清。

5.2实验用水

应符合GB/T6682中三级水的要求。

6仪器和设备

6.1培养箱：36℃±1℃。

6.2恒温水浴锅：45℃±1℃。

6.3高压灭菌器：121℃±1℃，15min。

6.4生物安全柜：Ⅱ级。

6.5均质器：转速8000r/min~10000r/min。

6.6天平：感量0.1g。

6.7pH计：精度±0.02。

6.8显微镜：1000倍油镜。

6.9移液器：10μL~1000μL。

6.10涡旋振荡器。

6.11无菌培养皿：直径90mm。

6.12无菌试管：16mm×150mm。

6.13无菌三角瓶：250mL、500mL。

6.14无菌离心管：15mL、50mL。

6.15无菌接种环：直径3mm。

6.16无菌移液管：1mL、5mL、10mL。

7样品采集与保存

7.1采样原则

7.1.1采样时应遵循无菌操作原则，避免样品受到污染。

7.1.2采样工具应预先灭菌，采样过程中不得接触其他物品。

7.1.3采样量应满足检验要求，固体食品不少于200g，液体食品不少于200mL。

7.1.4采样后应立即密封，并贴上标签，注明样品名称、采样日期、采样地点等信息。

7.2采样方法

7.2.1固体食品：使用无菌采样铲或无菌镊子从不同部位采集样品，放入无菌采样袋中。

7.2.2液体食品：使用无菌移液管或无菌采样瓶直接采集，注意避免气泡产生。

7.2.3半固体食品：使用无菌采样勺采集，放入无菌采样容器中。

7.3样品保存与运输

7.3.1样品采集后应立即置于4℃±2℃条件下保存，并尽快送至实验室。

7.3.3运输过程中应使用保温箱，确保温度维持在4℃±2℃。

7.3.4避免样品在运输过程中受到剧烈震动或温度变化。

8检验程序

8.1样品前处理

8.1.1固体样品：称取25g样品加入225mL无菌生理盐水中，均质器均质2min，制成1:10的样品匀液。

8.1.2液体样品：直接吸取25mL样品加入225mL无菌生理盐水中，充分混匀。

8.1.3半固体样品：称取25g样品加入225mL无菌生理盐水中，涡旋振荡混匀。

8.2增菌培养

8.2.1取10mL样品匀液加入90mLBCYEα液体培养基中，36℃±1℃培养48h。

8.2.2培养期间观察培养基浑浊度，如有明显浑浊可提前进行分离培养。

8.3分离培养

8.3.1取增菌培养液划线接种于BCYEα琼脂平板和L半胱氨酸缺失的BCYEα琼脂平板。

8.3.236℃±1℃培养5~7天，每天观察菌落生长情况。

8.3.3军团菌在BCYEα平板上呈灰白色、边缘整齐、有光泽的菌落，在L半胱氨酸缺失的BCYEα平板上不生长。

8.4初步鉴定

8.4.1挑取可疑菌落进行革兰氏染色，观察形态。

8.4.2进行氧化酶试验和触酶试验，军团菌应为氧化酶阴性、触酶阳性。

8.4.3进行马尿酸盐水解试验，军团菌应为阳性。

8.5血清学鉴定

8.5.1将初步鉴定为阳性的菌株进行血清学分型。

8.5.2使用军团菌分型血清进行玻片凝集试验。

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