基因工程实验流程总览.pptVIP

表达蛋白的纯化SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰胺胶分离不同大小的的蛋白。利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和树脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白，利用亲和层析洗脱出目标蛋白自动核酸/蛋白纯化工作站第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日目标蛋白功能分析抗体的制备：多抗、单抗DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交系统、噬菌体表面展示技术等第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日蛋白体内表达研究Westernblotting：利用抗原-抗体反应，对蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定量免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织细胞内的表达和定位蛋白质芯片系统第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日基因工程实验流程总览第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日DNA提取，纯化限制图谱琼脂糖电泳检测片段体外扩增PCR目的基因制备载体选择DNA重组片段连接未知核酸序列须DNA片段大小估计互补性黏性不互补性黏性末端平末端限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒物理化学法构建基因组文库PCR扩增基因的化学合成双抗体免疫法酶促反应mRNA-cDNA目的基因分离双酶切部分酶切Bal31逐步切割转座子基因定位克隆酵母双杂交前处理防止自连第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日RNA提取RT-PCRTA克隆蓝白选择胶回收表达引物PCR载体PCR产物回收转化感受态细胞第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日构建基因组文库真核生物有成千上万个碱基对，单个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增，所以只能对所有基因扩增，也就是构建基因组文库。第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日油菜TOC33基因片的克隆实验项目背景国家自然科学基金项目（油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆，编号。实验目的通过本综合实验，掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等，得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日具体实验步骤Ⅰ.植物基因组DNA的制备Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增Ⅲ.DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化IV.DNA片段的体外重组与转化V.克隆的筛选与鉴定VI.序列分析第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日Ⅰ.植物基因组DNA的制备取0.2g样品嫩叶至1.5mLEP管中，放在液氮中冷冻处理后，在EP管中充分捣碎，加入0.6mL抽提缓冲液，65℃水浴处理10min。12,000rpm离心3min，取上清，加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀，遇有絮状沉淀，4,000rpm离心5min。沉淀用50ulTE-RNase（5.0mMTris.HClpH8.0，1.0mMEDTApH8.0，RNaseA30ug/mL）溶解，37℃保温处理15min。加入二倍体积预冷的无水乙醇，-20℃下沉淀10min，4,000rpm离心3min，加适量70%乙醇洗沉淀，自然干燥或37℃烘干，加入50ulddH2O溶解备用。第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增引物设计，为扩增Toc33片段，用OLIG05.0设计1对PCR引物:上游引物P1:5一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3，下游引物P2：5一TTAAAGTGGCTTTCCACTTGTC一3。在0.2mLEppendorf管内配制25ul反应体系：10×PCRBuffer2.5ulMg2+1.5uldNTP1.0ulPrimer11.0ulPrimer21.0ulTaq酶0.5ul模板1.0ulddH2O16.5ul1)??????94oC预变性5min2)??????94oC变性30sec3)??????55