实验动物学细胞培养操作规程.docxVIP

实验动物学细胞培养操作规程

一、实验动物学细胞培养操作规程概述

细胞培养是实验动物学研究中的重要技术手段，广泛应用于基础医学、生物学、药理学等领域。本规程旨在规范细胞培养的操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性，同时保障操作人员的安全。规程内容涵盖细胞培养前的准备、细胞接种、培养维护、冻存与复苏等关键环节，并强调无菌操作和生物安全原则。

二、细胞培养前的准备

（一）实验室环境准备

1.确认细胞培养间符合无菌要求，空气洁净度达到10,000级或以上。

2.使用超净工作台，定期进行紫外线消毒和高效过滤器更换。

3.保持实验室温度在22–26℃，湿度控制在50–60%。

（二）器材与试剂准备

1.器材：细胞培养瓶、培养皿、移液器、离心管、冻存管等，需提前高压灭菌或使用无菌包装产品。

2.试剂：细胞培养基（如DMEM/F12）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、PBS缓冲液等，需验证合格并按说明书配制。

3.无菌操作：所有器材在使用前需用70–75%乙醇消毒表面，并确保操作过程避免污染。

（三）细胞系确认

1.核对细胞系名称、来源及保藏状态，避免混淆或污染。

2.新建细胞系需进行鉴定（如形态学观察、DNA指纹检测），确保为原始细胞。

三、细胞接种与培养

（一）细胞解冻与计数

1.将冻存细胞置于37℃水浴中快速解冻，立即加入预温培养基。

2.使用血球计数板或细胞计数仪计数细胞密度，调整至适宜接种浓度（通常为1×10^4–1×10^6cells/mL）。

（二）细胞接种步骤

1.将培养皿/瓶置于超净台内，加入适量培养基润湿底部。

2.用移液器吸取细胞悬液，均匀滴加至培养皿/瓶中，避免气泡产生。

3.轻轻晃动培养皿/瓶，使细胞分布均匀，静置培养。

（三）培养条件优化

1.温度：37℃，CO?浓度5%。

2.湿度：100%。

3.培养时间：贴壁细胞通常24–48小时后开始生长，悬浮细胞根据状态调整。

（四）日常维护

1.每隔1–2天观察细胞生长状态，记录形态变化（如贴壁、汇合度）。

2.及时补充培养基，避免浪费或污染。

3.生长旺盛的细胞需按比例传代，防止过度增殖导致老化。

四、细胞冻存与复苏

（一）细胞冻存

1.调整细胞密度至1×10^6–1×10^7cells/mL，加入冻存液（如DMSO+培养基混合液）。

2.分装至冻存管，逐层梯度冷冻（如-20℃保存过夜，再转移至-80℃或液氮）。

3.记录冻存信息（细胞系、冻存日期、编号）。

（二）细胞复苏

1.将冻存管快速置于37℃水浴融化，立即加入预温培养基稀释。

2.离心收集细胞，弃上清后重悬于新鲜培养基。

3.复苏后需观察细胞活性（如台盼蓝染色），合格后方可接种。

五、安全与废弃物处理

（一）生物安全

1.操作全程佩戴口罩、手套，避免直接接触细胞悬液。

2.使用一次性器材减少交叉污染风险。

（二）废弃物处理

1.培养基、细胞残渣等需经高压灭菌后统一处理。

2.废弃器材分类投放，符合实验室生物安全规定。

六、质量控制与记录

（一）质量监控

1.定期检测培养基pH值、无菌性，确保培养环境稳定。

2.细胞传代次数不宜超过50代，防止遗传背景改变。

（二）记录规范

1.详细记录每次操作的关键参数（如培养基批号、接种量、冻存条件）。

2.建立电子台账，便于追溯和问题排查。

**一、实验动物学细胞培养操作规程概述**

细胞培养是实验动物学研究中的重要技术手段，广泛应用于基础医学、生物学、药理学等领域。本规程旨在规范细胞培养的操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性，同时保障操作人员的安全。规程内容涵盖细胞培养前的准备、细胞接种、培养维护、冻存与复苏等关键环节，并强调无菌操作和生物安全原则。熟悉并严格执行本规程对于获得可靠实验数据至关重要。

**二、细胞培养前的准备**

（一）实验室环境准备

1.**确认细胞培养间符合无菌要求**：细胞培养间应具备空气洁净度等级（例如，生物安全柜内为层流洁净，或独立培养间达到10,000级或以上）。定期（如每周）进行空气微生物检测，确保环境符合标准。

2.**使用超净工作台**：每次使用前需进行清洁和消毒（如使用70-75%乙醇擦拭工作台面和周围区域）。启动工作台至少15分钟，使其达到稳定工作状态。使用期间避免频繁开关柜门，减少外界空气干扰。

3.**保持适宜温湿度**：实验室温度应维持在22–26℃，相对湿度控制在50–60%。过高或过低的温湿度都可能影响细胞生长和培养环境稳定性。

4.**紫外线消毒**：每日工作结束后或定期（如每周一次），关闭工作台内照明，使用紫外线灯照射至少30分钟，对工作区域进行空气和表面消毒。使用后需开启通风换气至少15分钟，去除残留紫外线。

5.**高效过