牛病毒病的多重检测完稿.pptVIP

牛病毒病的多重检测完稿第1页，共32页，星期日，2025年，2月5日摘要在临床上，牛的疱疹病毒(BHV-1),副流感病毒(PI3V),腹泻病毒(BVDV)，牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的诊断和监测常用ELISA方法。目前利用Luminex技术在血清学检测的基础上同时检测几种病毒的所有抗体的方法已经成为发展趋势在Luminex体系中，病毒的抗原和荧光微球偶联，检测血清样品。ELISA检测作为对照。与单独的ELISA检测相比，BHV-14和PI3VLuminex的多重检测表现出相似的敏感性和特异性。BVDV和BRSV的检测不是很成功，可能因为这些抗原的信号强度较弱，不能有效区分阳性和阴性样品。在Luminex体系中，BVDV的重组抗原在信号强度方面比未加工的BVDV抗原有所增加。第2页，共32页，星期日，2025年，2月5日研究背景牛传染性鼻气管炎由牛疱疹病毒(BHV-1)，副流感病毒(PI3V)，牛病毒性腹泻病毒（BVDV)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV）引起的牛的呼吸道传染病。BVDV和BHV-1也引起繁殖障碍，导致先天性流产和死胎。ELISA是常用的血清学检测方法，也适用于高通量筛选。在标准品阻断ELISA检测方法中所用的捕获抗原，是未经处理的病毒或来自组织培养病毒收获的细胞裂解液中纯化的病毒抗原，或者是纯化的具免疫原性的重组病毒蛋白但是ELISA方法的局限是在一个样品中只能使用一种生物素标记。因此，同样的血清样品必须用几种单独的ELISA进行血清学检测在同样的测定体系中能够检测几种靶标的多重检测技术对常规的血清学检测将有利于减少人力和物力，是一种新型的实验室检测方法第3页，共32页，星期日，2025年，2月5日Luminex多重检测原理液相芯片（LiquidArray)检测系统是由聚苯乙烯材料所制作的大小均一的圆形微球（直径为5.6um)，在其制作过程中包覆不同比例的红光及红外光发色剂两种荧光染料，而产生100种不同比例颜色微球，每个微球都有独特的色彩编号，具有其独特的地址。100种微球可依不同研究目的而偶联100种探针（如抗原、抗体、核酸、酶、各种受体等），这样可以同时对一个待测样本中的100种不同的目标分子进行检测。在检测过程中，微球单个逐一通过检测通道，微球通过检测通道时受到两束激光的同时照射，第一束635nm红色激光微球内部的突光物质，根据焚光编码确定微球的类别，即微球内部的两种荧光物质受激发后可发射两种不同波长的荧光，不同类别微球内这两种荧光物质比例不同，则荧光强度比率也不同，从而将不同的特异性反应区分开来（定性、分类）；第二束紫色激光激发报告分子上的荧光素，根据荧光强度确定微球上结合的报告分子（如SA-PE)的数量，从而确定目标分子数量（定量）系统只记录与红色荧光同时出现的绿色荧光信号，不记录未结合的报告分子荧光信号。最后通过分析软件进行数字化处理，分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样木中有无待检测病原体存在，或检测同时存在几种或数十种病原体。第4页，共32页，星期日，2025年，2月5日文章布局样品（阳性抗血清的制备；田间样品的采集）抗原制备ELISA检测抗原和Luminex微球的偶联（2步法）Luminex多重检测多重检测的可行性分析试验抗原的最佳稀释度确定阳性抗血清的特异性检测田间样品平行试验批内和批间的变异性分析BVDV的E2重组蛋白作为抗原的分析试验结果讨论第5页，共32页，星期日，2025年，2月5日2.11阳性抗血清的制备阳性对照抗血清来自试验感染的动物，BHV1抗血清来自断奶牛犊，鼻内或静脉接种BHV1的1和2亚型。BVDV抗血清来自于隔离培养的无特定病原体动物，鼻内和静脉注射BVDV的11亚型。BRSV和PI3V的阳性对照抗血清由疫苗接种获得。第6页，共32页，星期日，2025年，2月5日2.12田间样品的采集实验组血清来自于一定区域内不同品种，不同饲养场，圈养或散养的牛群（公畜或母畜）采集对象为诊断有呼吸系统疾病动物：如腹泻，抑郁，消瘦等。以及一些有繁殖障碍或死亡的家畜第7页，共32页，星期日，2025年，2月5日2.2抗原制备BHV1,PI3V,BVDV和BRSV的病毒抗原来自于未处理的细胞增值的病毒。BHV1(OxfordED6株),PI3(TI株)来自于牛肾细胞增值的的病毒，BRSV来自牛肾单层细胞增值的病毒，BVDV来自小牛睾丸细胞增值的病毒，待细胞病变达到80％-90％时，收集病毒，1500g离心，收取上清液。作为阳性抗