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双位点定点敲入Tet-on系统及PhiC31介导基因置换构建可诱导基因表达猪模型研究

一、引言

1.1研究背景与意义

基因修饰猪在生物医药和农业领域展现出了极高的价值。在生物医药领域，猪与人类在生理、代谢和解剖结构等方面具有诸多相似性，使得基因修饰猪成为研究人类疾病发病机制、开发新型治疗方法以及进行药物研发和安全性评估的理想动物模型。例如，通过基因编辑技术构建的疾病模型猪，能够模拟人类特定疾病的发生发展过程，为深入探究疾病的分子机制提供了有力工具。同时，基因修饰猪在异种器官移植研究中也具有巨大潜力，有望解决人类器官短缺的难题。

在农业领域，基因修饰猪可以通过改变其生长速度、肉质品质、抗病能力等重要经济性状，为畜牧业的可持续发展提供新的途径。比如，通过敲除或编辑特定基因，培育出具有更高瘦肉率、更强抗病性的猪品种，不仅可以提高养殖效益，还能减少养殖过程中抗生素的使用，保障食品安全和生态环境。

然而，传统的基因修饰猪模型存在一定的局限性，无法满足对基因表达进行精确时空调控的需求。为了更深入地研究基因功能及其在不同生理病理条件下的作用机制，构建可诱导基因表达的猪模型显得尤为重要。这种模型能够实现对外源基因表达的精准控制，根据实验需求在特定的时间和组织中开启或关闭基因表达，避免了基因持续表达可能带来的胚胎致死或其他不良影响，有助于更全面、准确地解析基因的功能和调控网络，为生物医药和农业领域的研究提供更强大、更精准的工具。

1.2国内外研究现状

在Tet-on系统研究方面，国外早在20世纪90年代就已经开始对其进行深入探索，并将其应用于细胞和小鼠模型中，实现了对目的基因表达的四环素（Dox）诱导调控。近年来，随着对Tet-on系统研究的不断深入，其在基因治疗、肿瘤研究等领域的应用也日益广泛。国内的研究团队也紧跟国际步伐，在Tet-on系统的优化和应用方面取得了一系列成果，如改进Tet-on系统的组件，提高其诱导效率和特异性，降低背景表达。

PhiC31介导基因置换技术的研究，国外在早期就通过对PhiC31整合酶的作用机制进行研究，成功将其应用于多种生物的基因组定点整合，包括果蝇、斑马鱼等模式生物。在猪模型构建方面，国外研究人员尝试利用PhiC31介导基因置换技术构建基因修饰猪，但仍面临一些技术挑战，如整合效率较低、脱靶效应等。国内相关研究起步相对较晚，但发展迅速，研究人员在优化PhiC31介导基因置换技术的条件，提高整合效率和准确性方面进行了大量研究，并取得了一定的进展。

在构建相关猪模型方面，国外已经成功构建了多种基因修饰猪模型，如通过Tet-on系统调控特定基因表达的猪模型用于肿瘤研究和神经退行性疾病研究；利用PhiC31介导基因置换技术构建的基因敲入猪模型用于研究基因功能。国内研究团队也在积极开展相关工作，构建了一系列具有自主知识产权的基因修饰猪模型，在疾病模型构建、农业性状改良等方面取得了显著成果。然而，目前国内外在构建双位点定点敲入Tet-on系统及PhiC31介导基因置换猪模型方面的研究仍处于探索阶段，尚未形成成熟的技术体系，存在诱导效率不高、模型稳定性差等问题，需要进一步深入研究和优化。

1.3研究目标与内容

本研究旨在构建双位点定点敲入Tet-on系统及PhiC31介导基因置换猪模型，具体研究内容如下：

双位点定点敲入Tet-on系统的构建：通过设计特异性的打靶载体，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将Tet-on系统的关键元件rtTA（反向四环素调控转录激活因子）和TRE3G（四环素响应元件）双位点定点敲入猪基因组的特定位置，实现对目的基因表达的四环素诱导调控。优化打靶载体的设计和转染条件，提高双位点定点敲入的效率和准确性，通过细胞筛选和鉴定，获得稳定整合Tet-on系统的猪体细胞

二、相关理论基础

2.1Tet-on系统原理与机制

Tet-on系统作为一种可诱导的基因表达调控系统，在现代生物学研究中具有举足轻重的地位。该系统主要由调节表达载体和反应表达载体两大部分组成。调节表达载体包含人巨细胞病毒早期启动子（PhCMV）和反向四环素调控转录激活因子（rtTA），其中rtTA是由反义TetR（rTetR）与单纯疱疹病毒（HSV）VP16蛋白C端的一段转录激活区域融合而成。反应表达载体则由Tet应答元件（TRE）、最小CMV启动子（PminCMV）及目的基因构成，TRE由7个重复的TetO序列组成。

Tet-on系统的工作原理基于四环素（或其衍生物强力霉素，Dox）对基因表达的调控作用。在生理条件下，由于rtTA的构象特点，其与TRE不能结合，同时PminCMV缺少增强子